在大动物中,大多数性状属于数量性状,而水牛的产奶性状更是一个复杂的数量性状。在以往研究中多数是针对一个靶基因进行调控,很难达到调控产奶量和奶品质的目的,且大多数研究都停留在对基因进行敲除,而研究长片段基因敲入的报道还相对较少。目前,转基因技术在多基因联合调控方面还不够成熟。本研究针对水牛基因组rDNA位点采用CRISPR/Cas9技术,探索PRL、DGAT1、CSN1S1多基因定点整合的可行性。首先,在基因打靶载体pUC19-DS1-PRL-DS2中加入筛选基因Neo,并对水牛肾脏成纤维细胞的转染条件进行摸索和细胞的筛选。其次对课题组前期针对水牛rDNA基因组位点设计的3个CRISPR/Cas9-1、CRISPR/Cas9-2、CRISPR/Cas9-3的切割活性进行了T7E1和克隆测序分析。接着分别共转染CRISPR/Cas9与3个基因打靶载体pUC19-DS1-PRL-2A-Neo-DS2、pUC19-DS1-DGAT1-2A-Zeocin-DS2、pUC19-DS1-shRNA-2A-Neo-DS2,并检测了基因整合与定点整合情况。结果表明,成功在基因表达载体中加入筛选基因。确定了水牛成纤维细胞的G418最佳筛选浓度为400?g/mL。在对CRISPR/Cas9的活性检测中,发现其切割效率均在60.0%以上,最高达70.0%,基因位点出现不同程度的碱基插入缺失和突变。在3个基因打靶载体对基因整合的有效性检测中,发现基因都有整合。为了进一步确定基因的整合位点,我们在跨HRDS1同源臂测序时发现PRL基因的定点整合,在跨HRDS2同源臂测序时发现DGAT1基因的定点整合,而针对CSN1S1基因的shRNA未检测到定点整合。综上所述,在水牛基因rDN A位点中CRISPR/Cas9能够有效地介导基因的定点整合。