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【研究背景及目的】原发性肝癌是世界第五大常见肿瘤之一,其死亡率在恶性肿瘤中为第三位。原发性肝癌患者中有85%到90%为肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）。虽然,在过去的几十年中肝癌的诊断及治疗已经取得了很大的进步和突破,但由于慢性肝炎及肝硬化病人是肝癌的高危人群,所以肝癌的预防仍是全球关注热点。肝细胞核因子4（hepatocyte nuclear factor 4,HNF4）是一种属于细胞核激素受体家族的转录因子,在分化成熟的肝细胞中高表达,其中HNF4α是HNF4的重要亚型。HNF4α参与维护肝细胞脂肪代谢、白蛋白合成、药物解毒、能量代谢、胆汁酸合成等重要功能,也是调控上皮细胞表型表达的重要基因。近年的研究提示,HNF4α对上皮细胞间质转型（epithelial-to-mesenchymal transition,EMT）有重要的调控作用。本课题组前期研究发现,HNF4α可以促进肝癌细胞向肝细胞分化,抑制肿瘤细胞增殖和体内肿瘤生长。EMT主要是指上皮细胞在细胞形态、细胞结构、细胞功能以及细胞粘附、迁移能力等方面获得间质细胞特性的过程。近年来研究发现,EMT不仅在肿瘤浸润转移过程中的起重要作用,而且肿瘤细胞发生EMT后成瘤性明显增强并获得了干细胞特性,提示EMT与肿瘤的发生有关。Wnt/β-catenin信号通路在众多组织中是调控细胞增殖、分化和迁移的重要通路,在肝脏的各种生物学功能中同样发挥着重要作用。β-catenin既是细胞连接的重要组成部分,又是经典Wnt信号通路的关键信号分子。在肝脏纤维化及肝癌发生过程中,伴随着EMT现象的出现,普遍存在Wnt/β-catenin信号通路的异常激活,即β-catenin在细胞浆的聚集和/或核转位。另外,在肝前体细胞及肝癌干细胞活化的过程中Wnt/β-catenin信号通路也起着重要的作用。本课题将系统研究HNF4α对实验性肝癌发生的预防作用,深入探讨其生物学作用的分子机制,为应用HNF4α防治肝癌的临床研究奠定实验基础。【实验方法】一、HNF4α预防实验性大鼠肝癌1.利用AdEasyTM系统构建表达HNF4α的重组腺病毒—AdHNF4α,293细胞包装并反复感染,扩增高效表达HNF4α的AdHNF4α和空白对照病毒AdGFP,浓缩纯化、测定滴度后保存。2.AdHNF4α抑制DEN诱导大鼠肝癌形成雄性Wistar大鼠50只,正常对照组12只,其余DEN诱癌组共38只。第1组为正常对照组;第2～4组予DEN溶液按70 mg/kg剂量腹腔注射,每周注射1次,连续注射10 w,制备DEN诱导的大鼠肝癌模型。其中第2组设为模型对照组;第3组为空白病毒AdGFP对照组;第4组设为AdHNF4α导入组。于DEN注射第10 w经尾静脉分别注入5×109 pfu AdGFP和5×109 pfu AdHNF4α,之后分别于第12 w、14 w、16 w、18 w及20 w经尾静脉给予注射相同滴度的病毒,并在10 w、11 w、15 w及18 w每组随机处死2只大鼠,在22 w处死剩余大鼠。分别观察各组大鼠肝脏大体变化;HE染色观察病理变化;免疫组织化学法测定α-SMA、AFP、PCNA表达;Masson’strichrome及Sirius Red染色测定ECM含量并对肝纤维化程度分级,图象分析仪半定量分析。二、HNF4α抑制肝细胞EMT和肝癌前体细胞产生的研究1.Real time RT-PCR和免疫组织化学方法,分别检测正常、DEN诱癌大鼠肝组织HNF4α及EMT相关基因（E-cadherin、vimentin、snail、TGF-β1）的表达;同时检测HNF4α导入后HNF4α及EMT相关基因的表达。2.免疫组织化学方法检测10例人原发性肝癌标本中HNF4α及EMT相关基因（E-cadherin、vimentin）的表达。3.分离原代培养大鼠肝细胞,培养2 d后,换成含有2 ng/ml TGF-β1无血清培养基,同时将AdGFP或AdHNF4α以感染复数（multiplicity of infection,MOI）10感染肝细胞,动态观察细胞形态变化;收集感染48 h、72 h后细胞,抽提总RNA和蛋白。Real time RT-PCR法检测肝细胞HNF4α、白蛋白（albumin,ALB）、上皮细胞钙粘蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（vimentin）、snail、Ⅰ型胶原mRNA水平表达;细胞间接免疫荧光检测EMT相关基因（E-cadherin、vimentin、snail）表达;Western Blot检测相应蛋白水平变化。4.免疫组织化学方法检测大鼠肝组织内肝前体细胞/肝癌干细胞相关基因（OV-6、EpCAM）的表达和分布情况。三、HNF4α对Wnt/β-catenin信号转导通路的活性的影响1.利用报告基因检测系统分析HNF4α在293T、HepG2和BRL中对β-catenin转录活性的抑制。2.通过核质分离后利用Western blot方法检测HNF4α对TGF-β1激活的肝细胞β-catenin核转位的调节。3.免疫组织化学方法检测各实验组大鼠肝组织内β-catenin的表达和分布情况。【实验结果】一、HNF4α抑制实验性大鼠肝癌发生1.随DEN诱癌进程,模型对照及病毒对照组大鼠逐渐出现肝纤维化、肝硬化及肝癌的病理表现。在诱癌第22 w,模型组及病毒对照组（6只/组）大鼠肝硬化明显,全部出现癌结节,HNF4α组（6只/组）均没有发现肿瘤。2.Masson’s trichrome及Sirius Red胶原染色结果半定量分析发现AdHNF4α组面积约为AdGFP组的49%（P＜0.05）,免疫组化表明α-SMA表达较AdGFP组均显著下降（P＜0.05）。3.免疫组化结果半定量分析,结果表明HNF4α组AFP及PCNA表达较AdGFP组显著减少（P＜0.05）。二、HNF4α抑制肝细胞EMT及肝癌前体细胞的产生1.在DEN诱导大鼠肝癌形成过程中HNF4α及EMT相关指标的变化:Real timeRT-PCR及免疫组织化学检测提示随肝纤维化及肝癌发生肝组织内HNF4α表达逐渐下降;同时,上皮细胞标志物E-cadherin较正常组明显减少（P＜0.05）,间质细胞标志物较正常组明显增加（P＜0.05）。2.HNF4α对DEN肝癌模型肝组织EMT相关基因表达影响:Real time RT-PCR及免疫组织化学检测显示AdHNF4α导入组E-cadherin表达较AdGFP导入组及模型组显著增加（P＜0.01）,而Snail、Vimentin表达均显著减少（P＜0.05）。3.将含有TGF-β1无血清培养基刺激原代大鼠肝细胞,48 h后可见较多死亡细胞,细胞数量减少,形态由多边形向梭形转变;72 h后见死亡细胞进一步增多,活细胞数量较少且大多数呈现间质细胞梭形形态。Real time RT-PCR及间接免疫荧光检测Vimentin、Snail表达均明显增强（P＜0.05）,而E-cadherin、HNF4α表达明显减少（P＜0.05）。4.将MOI 10的AdHNF4α和AdGFP分别感染TGF-β1刺激的原代大鼠肝细胞,48 h后AdHNF4α组细胞死亡数量较AdGFP组明显减少,细胞形态仍保持多边形;72 h后AdGFP组活细胞数量较少且大多数呈现间质细胞梭形形态,AdHNF4α组细胞死亡细胞很少且大多仍保持多边形形态。Real time RT-PCR检测AdHNF4α组HNF4α表达明显上调,Vimentin和Snail表达均明显减少（P＜0.05）,E-cadherin明显增加（P＜0.05）。5.AdHNF4α组肝前体/肿瘤干细胞OV-6及EpCAM阳性细胞比例较AdGFP组明显减少（P＜0.05）。三、HNF4α下调Wnt/β-catenin信号转导通路的活性1.AdHNF4α可以明显抑制293T和HepG2细胞β-catenin报告基因的活化,并随着AdHNF4α的滴度增加逐渐增强,即呈现一定的剂量依赖性。2.AdHNF4α可明显抑制由TGF-β1刺激引起肝细胞β-catenin的核内转位,从而抑制Wnt/β-catenin通路的活化。3.免疫组织化学检测提示DEN诱导大鼠肝癌形成过程中,肝细胞膜上β-catenin逐渐减少并出现胞浆和/或核内聚集,AdHNF4α组较AdGFP组β-catenin的核转位明显减少（P＜0.05）。【结论】1.实验性大鼠肝硬化、肝癌进程及人肝癌的发生过程中,肝细胞HNF4α表达逐渐降低并出现EMT现象。2.HNF4α可明显抑制大鼠肝纤维化和肝硬化程度,有效预防肝癌的发生。3.HNF4α预防肝癌发生的主要机制是通过下调Wnt/β-catenin通路的活性而抑制肝细胞EMT及肝癌干细胞的产生。