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初情期是动物首次出现发情排卵的年龄,是开始获得繁殖能力的标志。初情期的启动,是由下丘脑GnRH神经元控制。从目前的研究报道看,初情期启动的机制实际上是GnRH脉冲式释放的调控,是非类固醇介导的中枢机制,调控因素包括神经肽、神经递质、神经类固醇。主要参与调控GnRH释放的神经肽有鸦片肽、NPY、促生长激素神经肽(Galanin)、促皮质激素释放激素(CRF)；神经递质有去甲肾上腺素(NE)、多巴胺、5-羟色胺、褪黑激素、Y氨基丁酸(GABA),但其具体调控机制还需进一步研究探讨。目前,关于初情期启动相关基因受体NPY-Y1、GPR54、Ob-Rb基因的研究报道较少,特别是关于他们对初情期启动的调控机制几乎没有报道。本研究系统的研究初情期启动相关基因受体NPY-Y1、GPR54、Ob-Rb基因在下丘脑-垂体-卵巢内的组织定位及其组织发育性变化,目的是为深入研究探讨NPY-Y1、GPR54、Ob-Rb在初情期启动中扮演的角色。同时本实验还采用mRNA差异显示(mRNA DD)技术对猪初情期启动的关键因子做进一步的研究,以筛选与猪初情期启动相关的重要基因。主要研究结果如下：1.根据GenBank发表的序列设计NPY-Y1、GPR54、Ob-Rb基因特异性引物,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出NPY-Y1、GPR54、Ob-Rb基因的部分cDNA序列,扩增产物克隆入pGEM-T easy载体中进行序列测定。结果：与发表的猪NPY-Y1、GPR54、Ob-Rb基因序列(NO.AF106081,NO.DQ459346,NO.AF092422)同源性均为100%,说明所扩增的序列为本实验所要的,为后续研究奠定了基础。2.用原位杂交技术检测苏姜猪母猪初情期前后NPY-Y1 mRNA在下丘脑、垂体和卵巢的分布定位。结果：在苏姜猪初情期前后下丘脑、垂体和卵巢三种组织中,均检测到NPY-Y1 mRNA阳性杂交信号。下丘脑的阳性杂交信号主要集中在丘脑室旁核和下丘脑的弓状核、室旁核、室周核等处；在垂体中分布相对密集；各级卵泡颗粒细胞和内膜细胞中均有阳性杂交信号,间质中也有少量的杂交信号。在三种组织中NPY-Y1 mRNA杂交信号均初情期较弱,初情期前相对较强。结果可以初步证明NPY-Y1在下丘脑-垂体-卵巢轴对雌性生殖的调节中具有关键的调控作用,并且对下丘脑-垂体-卵巢轴具有调控作用。3.用原位杂交技术检测苏姜猪母猪初情期前后GPR54 mRNA在下丘脑、垂体和卵巢的分布定位。结果：在苏姜猪初情期前后下丘脑、垂体和卵巢三种组织中,均检测到GPR54 mRNA阳性杂交信号。下丘脑的阳性杂交信号主要集中在弓状核和腹内侧核中,其它区也有一定的表达；在垂体中分布相对密集；各级卵泡颗粒细胞和内膜细胞中均有阳性杂交信号,间质中也有少量的杂交信号,大卵泡的阳性率明显高于小卵泡。在三种组织中GPR54 mRNA杂交信号均初情期较强,初情期前相对较弱些。结果可以初步证明GPR54在下丘脑-垂体-卵巢轴对雌性生殖的调节中具有关键的调控作用,并且对下丘脑-垂体-卵巢轴具有调控作用。4.用免疫组织化学的方法测定苏姜猪母猪初情期前后下丘脑、垂体、卵巢内Ob-Rb的分布及定位。结果：Ob-Rb阳性颗粒广泛分布于下丘脑,尤其是弓状核；垂体中Ob-Rb阳性颗粒主要集中于垂体前叶细胞；卵巢中Ob-Rb阳性颗粒出现在各级卵泡的颗粒细胞,而卵母细胞没有阳性颗粒。结果可以初步证明Ob-Rb在下丘脑-垂体-卵巢轴对雌性生殖的调节中也具有关键的调控作用。5.用荧光定量PCR技术检测苏姜猪初生、60、120、初情期、180日龄五个不同发育阶段的下丘脑、垂体和卵巢三种组织中NPY-Y1、GPR54、Ob-Rb mRNA的表达丰度变化。结果：(1)下丘脑、垂体与卵巢内NPY-Y1 mRNA表达量从初生到初情期表达量逐渐下降,在初情期达到最低,初情期后呈上升趋势。下丘脑内各个时期NPY-Y1 mRNA表达量均存在显著差异(P<0.05),垂体内120日龄与180日龄之间NPY-Y1 mRNA表达量差异不显著(P>0.05),其它时期NPY-Y1 mRNA表达量均显著差异(P<0.05),卵巢内初情期与180日龄之间NPY-Y1 mRNA表达量差异不显著(P>0.05),其它时期NPY-Y1 mRNA表达量均显著差异(P<0.05)。(2)下丘脑、垂体与卵巢内GPR54 mRNA表达量均从初生到初情期表达量逐渐上升,在初情期达到最高,初情期后呈下降趋势。下丘脑内初情期与初生、180日龄的GPR54 mRNA表达量差异均达到显著水平(P<0.05),垂体内初情期与初生、60日龄、180日龄的GPR54 mRNA表达量差异均达到显著水平(P<0.05),卵巢内初情期与初生、60日龄、120日龄、180日龄的GPR54 mRNA表达量差异均达到显著水平(P<0.05)。(3)下丘脑、垂体与卵巢内Ob-Rb mRNA发育性变化模式与NPY-Y1基本相同,从初生到初情期表达量逐渐下降,在初情期达到最低,初情期后呈上升趋势。下丘脑内120日龄、初情期与180日龄之间Ob-Rb mRNA表达量差异不显著(P>0.05),其它时期NPY-Y1 mRNA表达量均显著差异(P<0.05),垂体内60日龄与120日龄之间Ob-Rb mRNA表达量差异不显著(P>0.05),其它时期NPY-Y1 mRNA表达量均显著差异(P<0.05),卵巢内初情期与180日龄之间Ob-Rb mRNA表达量差异不显著(P>0.05),其它时期Ob-Rb mRNA表达量均显著差异(P<0.05)。结果初步显示了三种受体在猪下丘脑-垂体-卵巢生殖轴中不同发育时期的变化,并且证明发育时期中NPY对GnRH释放起到是抑制作用,而leptin对GnRH起释放作用,低剂量的leptin可促进GnRH-LH的分泌,高浓度则抑制其分泌,这为以后的研究提供了可靠的科学数据。6.采用mRNA差异显示技术、Reverse Northern技术以及半定量分析技术,对不同发育时期猪下丘脑差异表达的ESTs进行分离,共得到cDNA差异片断20条,半定量分析显示：其中5条差异条带在出生时呈表达增强相,11条差异条带在初情期时呈表达增强相,其余4条在性成熟时呈表达增强相。测序结果与GenBank数据库比对,二个cDNA与已知基因同源,其余大部分都是功能未知的EST序列。经Reverse Northern验证,有9个cDNA呈阳性,可用于下一步探针定位及表达的研究。