背景：艾滋病是以全身免疫系统严重损害为特征的传染性疾病,自其被发现以来,已严重威胁人类的生存,对全球人口健康和社会经济的发展产生巨大的影响。伴随着多年来的研究,艾滋病在治疗上取得了很大的进展,譬如高效抗逆转录病毒治疗(Highly active antiretroviral therapy,HAART,又称为“鸡尾酒”疗法)的应用。但是,病毒耐药一直是艾滋病治疗的第一大问题,有些患者甚至一开始就对某些药物耐药。而艾滋病的预防,包括HIV疫苗以及杀微生物剂(Microbicides)的研发,更是进展缓慢。一些人体内存在的增强病毒感染的因素,如抗体依赖性的病毒增强作用,被认为是导致艾滋病疫苗失败的一大原因。近年来有研究表明精液本身能成数量级地促进HIV感染,可能是多个杀微生物剂大规模临床试验失败的原因之一。此外,一些病毒自身的蛋白,比如HIV Nef,也能增强HIV的感染和传播。正是由于对HIV的传播和免疫清除机制不甚了解,导致至今仍然没有成功的HIV疫苗和杀微生物剂可供艾滋病的预防。现有的抗艾滋病药物也不能彻底根治这一疾病。　　 在本课题组成员的前期研究中,我们发现衍生于HIV-1 MN毒株包膜蛋白的病毒与辅助受体结合的位点的多肽6313和跨膜区的多肽6380能拮抗HIV融合抑制剂T-20的抗病毒活性,当时推测由于T-20能特异与gp120辅助受体结合区和gp41跨膜区结合,因而具有多靶点的抗HIV融合的机制。然而,进一步研究发现T-20不能与gp120辅助受体结合区或gp41跨膜区结合。相反,这区段的多肽能显著地促进HIV的感染活性。正是由于这种增强病毒感染的效应,抵消了T-20的抑制活性。那么gp120其它区段的多肽也具有增强病毒感染的活性吗?这些多肽增强病毒感染活性的机制是什么呢?多肽MN-6313能拮抗T-20的抗病毒活性,那么MN-6313也能拮抗其它临床上使用的抗病毒药物的抗病毒活性吗?gp120是裸露在细胞表面,而且游离的gp120是存在于机体内的,在体内各种酶、催化抗体存在下,gp120能否水解出这些能增强病毒感染的多肽,从而促进AIDS疾病的病程吗?对于这些问题的阐明将有助于深入了解艾滋病的发病机制、疾病进程,并为艾滋病疫苗的开发和艾滋病辅助治疗药物新靶点的寻找提供依据。　　 联合国2009年全球艾滋病流行状况报告显示,异性间性传播已成为艾滋病传播的主要途径,其比例高达80％,在非洲一些国家更高达90％。在中国性传播已成为艾滋病的最主要传播途径。因此,阴道局部使用的杀微生物剂(microbicide),被认为是预防HIV传染的有效手段。专家曾预测,第一代杀微生物剂有望在2010年上市。然而,至今还没有一个成功的杀微生物剂问世。有6个候选的杀微生物剂已完成Ⅱ/Ⅲ期临床,试验结果都令人失望。其中三个是阴离子多聚物。这类化合物没有预防HIV感染的疗效,个别还增加HIV感染的机率。　　 研究发现,精液来源的病毒增强因子(Semen-derived Enhancer of VirusInfection,SEVI)能形成淀粉样纤维并增强病毒的感染。蛋白聚糖的糖链在很多淀粉样沉积疾病发挥着重要的作用。鉴于蛋白聚糖的糖链与阴离子多聚物类杀微生物剂具有相似的结构,阴离子多聚物类杀微生物剂能否与精液来源的病毒增强因子相互作用并促进精液来源的病毒增强因子的形成,成为这类候选杀微生物剂临床失败的分子机制呢?　　 因此本课题拟进行以下两部分内容的探讨:(1)衍生于HIV-1gp120淀粉样多肽促进病毒感染机制的研究。对衍生于X4病毒株HIV-1 MN包膜蛋白的全序列多肽进行扫描,寻找具有增强病毒感染的活性多肽,深入研究这些多肽促进病毒感染的机制；分析淀粉样多肽对于目前高效抗逆转录病毒治疗药物抗病毒药效的影响;初步探讨HIV-1 gp120体外的降解。(2)精液来源的病毒增强因子拮抗阴离子聚合物抗病毒分子机制的研究。拟采用生物物理、生物化学手段,深入研究阴离子多聚物与精液蛋白的相互作用,探讨其对精液蛋白淀粉样纤维形成的影响,分析精液蛋白降低阴离子多聚物抗HIV活性的分子机制。　　 第一部分、来源于HIV-1 gp120的淀粉样多肽促进病毒感染的研究　　 目的:建立不同嗜性的HIV-1感染性克隆(X4、R5、X4R5受体嗜性的感染克隆)体系,利用衍生于X4病毒株HIV-1 MN包膜蛋白的全序列多肽筛选具有增强病毒感染活性的多肽片段；深入研究这些多肽促进病毒感染的机制,探讨这些具有增强病毒感染活性的多肽对当前高效抗逆转录病毒治疗(HAART)药物抗病毒药效的影响；初步研究HIV-1gp120体外的降解及分析降解产物；寻找有效的小分子药物拮抗包膜蛋白衍生的多肽促进病毒感染的活性。　　 方法:　　 1.建立了CCR5,CXCR4,X4R5不同受体嗜性的克隆病毒系统,将表达NL4-3(X4受体嗜性的)病毒全长基因的质粒,81A(R5受体嗜性的)病毒全长基因的质粒和嵌合了NL4-3和81A病毒(双受体嗜性)全长基因的质粒分别转染至293T细胞,收集的病毒上清液用于多肽对病毒感染的促进作用的研究。利用X4病毒株HIV-1 MN包膜蛋白的全序列多肽筛选具有增强病毒感染活性的多肽片段。利用不同的HIV-1临床分离株,不同的细胞感染方式,包括自由病毒感染靶细胞,病毒在细胞-细胞间的传播来研究与确证筛选出来具有增强病毒感染活性的作用。通过PyMOL软件分析,多肽序列对比,分析这些HIV-1 gp120来源的具有增强病毒感染多肽的结构特点。XTT毒性实验研究多肽对于靶细胞的毒性作用。　　 2.利用生物化学、物理化学、病毒学的方法对这些具有增强病毒感染多肽的机制进行深入研究。首先利用硫磺素T染色法,透射电子显微镜法确证这些具有增强病毒感染的多肽能形成淀粉样纤维；利用Time-of-addition,eGFP标记的假病毒体系结合细胞的实验研究这些具有增强病毒感染的淀粉样多肽是作用在病毒进入的阶段；设计Virus pull-down assay,cell-binding assay及阴离子多聚物拮抗结合的实验研究具有增强病毒感染的淀粉样多肽是通过结合病毒和靶细胞,从而把两者拉近来促进病毒的感染。　　 3.选用当今临床应用的高效抗逆转录病毒治疗药物,包括进入抑制剂,非/核苷类逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂等药物,通过设立药物对照组、药物+多肽组,研究这些药物在淀粉样多肽存在下,抗病毒活性的变化。主要讨论淀粉样多肽对临床抗HIV药物抗实验株病毒ⅢB(X4型病毒)和BaL(R5型病毒)感染活性的影响。　　 4.通过与硫磺素T结合实验、刚果红结合实验、透射电镜等方法分析小分子化合物表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对于抑制淀粉样多肽纤维的形成作用以及打断成熟的淀粉样纤维的形态的作用。利用病毒感染实验,观察EGCG拮抗淀粉样多肽促进病毒感染的作用,分析EGCG是否能恢复由于淀粉样多肽存在抗病毒药物降低的抗病毒活性。　　 5.建立Western blot方法,追踪分析体外HIV-1 gp120降解的成分,通过透射电镜的观察,探讨HIV-1 gp120降解产物形成淀粉样纤维的可能。　　 结果:　　 1.优化实验条件,在低浓度病毒感染下,利用克隆病毒体系,建立了研究多肽促进病毒感染的病毒系统。　　 2.从120多条衍生于HIV-1gp120的含15个氨基酸的多肽中,筛选出近1/3的多肽具有增强病毒感染的活性,这些多肽普遍对HIV-1不同受体嗜性的克隆病毒、临床分离的病毒毒株(包括A、B、C、D亚型的毒株),都有增强病毒感染的活性,也具有促进病毒在细胞-细胞间的传播作用。　　 3.通过PyMOL软件分析,多肽序列对比,我们发现这些具有增强病毒感染活性的多肽来源于HIV-1gp120的β-折叠结构域,与来源于α-螺旋区域的多肽比较,增强病毒感染的活性有显著差异(P＜0.05)。这提示来源于β-折叠结构的多肽更容易促进病毒感染。由于这些增强病毒感染的多肽溶液大多是浑浊的,经硫磺素T染色法和透射电子显微镜观察,发现这些促进病毒感染的多肽都能形成淀粉样纤维。淀粉样纤维是一种富含β-片层结构的大分子聚合物。　　 4.这些HIV-1gp120来源的淀粉样多肽能促进病毒感染的活性是作用在病毒进入阶段。Time-of-addition实验表明,病毒在结合细胞后加入多肽,与病毒在结合细胞前加入多肽相比较,多肽对病毒增强作用有显著性差异(P=0.000)。利用eGFP标记的HIV-1 NL4-3假病毒系统表明,在4℃温度下(病毒并不进入细胞内),用流式细胞仪检测,淀粉样多肽能促进病毒结合到细胞表面。Viruspull-down assay,cell-binding assay表明,这些淀粉样多肽能分别捕获病毒或结合到细胞表面,从而增强病毒的感染性。但阴离子聚合物未能拮抗gp120衍生的淀粉样多肽对病毒与细胞的结合,这说明gp120衍生的淀粉样多肽不是依靠静电吸附力与病毒或细胞结合的。　　 5.来源于gp120β20的淀粉样多肽6313能降低高效抗逆转录病毒治疗药物的抗病毒活性,2μM的6313能使抗病毒药物的抗病毒活性降低3-16倍。　　 6.EGCG能有效的抑制gp120来源的淀粉样多肽的形成,阻断淀粉样纤维的形态,拮抗淀粉样多肽介导的增强病毒感染的活性,使抗病毒药物,在淀粉样多肽存在降低的抗病毒活性恢复正常水平。　　 7.体外gp120多肽的降解实验表明,在37℃孵育下,gp120能缓慢释放一些小分子量短肽片段(～4K),而且通过透射电镜能观察出淀粉样纤维状物质。　　 结论:　　 1.低浓度病毒量适用于多肽/化合物增强病毒感染活性的检测。　　 2.HIV-1gp120衍生的具有增强病毒感染活性的多肽来源于gp120β-折叠区域,其促进病毒感染的机制是形成富含β-片层结构的淀粉样纤维状的聚合物,这些大分子聚合物能结合病毒与靶细胞,从而把两者拉近,促进病毒的感染。gp120衍生淀粉样多肽能广谱促进不同亚型,不同受体嗜性病毒的感染,而且也能促进病毒在细胞-细胞间的传播。　　 3.这些来源于gp120β-折叠区域的多肽,有可能原因具有结构的优势,易于聚集形成β-片层结构而形成淀粉样纤维的形态,进而促进病毒的感染。对于多肽二级结构与淀粉样形成趋势相关性的研究与分析,对于我们科研工作中随机设计合成淀粉样多肽用于一些基因治疗药物或技术的开发提供新思路。　　 4.体外HIV-1gp120降解实验初步证明,在37℃孵育条件下,gp120不稳定,能释放出一些小分子量的多肽,并检测出淀粉样纤维的存在。这些淀粉样多肽不仅能促进病毒的感染,而且能拮抗抗病毒药物的抗病毒活性,也即说明,这些淀粉样物质的存在,能降低病人对药物的敏感性。虽然现在普遍认为病人的耐药性与病毒的基因突变相关,但有文献报道[58],在产生耐药的人群中,有接近20％的病例可能与病毒基因型耐药无关。HIV-1gp120是存在于人体内的。那么,在人体内HIV-1 gp120是否能降解释放出这些淀粉样多肽,从而一方面促进病毒感染,影响疾病的进程?另一方面使病人对药物的敏感性降低呢?本课题的研究为回答以上两个gp120降解生理意义的研究奠定基础。　　 5.EGCG是一个有效的抑制和阻断淀粉样物质的小分子药物。EGCG能有效的抑制gp120来源的多肽形成淀粉样结构,阻断淀粉样纤维的形态,拮抗淀粉样多肽增强病毒感染的活性,使抗病毒药物在淀粉样多肽存在降低的抗病毒活性得到恢复。　　 第二部分、精液蛋白拮抗阴离子型多聚物类杀微生物剂抗HIV活性的分子机制研究　　 目的:本研究拟采用多种生物物理、生物化学手段,深入研究阴离子多聚物类杀微生物剂与精液来源的病毒增强因子(SEVI)的相互作用及机制,从而从药物-宿主蛋白相互作用的角度,阐明一个阴离子多聚物类杀微生物剂临床试验失败的原因。研究内容包括阴离子多聚物杀微生物剂促进精液来源的病毒增强因子的淀粉样纤维的形成,阴离子多聚物与精液相关蛋白的相互作用,以及相关的药物抗病毒活性的评价。研究结果将提示精液蛋白对于评价杀微生物剂的重要性,也将指出哪类药物不适合开发为杀微生物剂,对于未来杀微生物剂的研发具有重要的理论指导意义。　　 方法:　　 1.我们选取以下阴离子多聚物类杀微生物剂作为我们研究的对象,包括:硫酸纤维素(Cellulose sulfate,CS),角叉菜胶(Carrageenan),邻苯二甲酸纤维素(Cellulose acetate1,2-benzenedicarboxylate,CAP),聚苯乙烯磺酸钠(Polystyrene sulfonate)。建立起一系列生物物理、生物化学手段,包括硫磺素T染色法,刚果红染色法,圆二色谱法,透射电镜法,探讨阴离子多聚物类杀微生物剂促进精液来源的病毒增强因子,即SEVI,淀粉样纤维形成的作用。并考察这种促进作用的量效关系。　　 2.建立酸性凝胶电泳法、Western blot及ELISA分析阴离子多聚物类杀微生物剂与精液来源多肽(即SEVI原型多肽PAP248-286)的相互作用。　　 3.分别考察在PAP248-286或精液存在下,阴离子多聚物类杀微生物剂抗实验株病毒ⅢB(X4型病毒)和BaL(R5型病毒)感染活性的影响。　　 4.考察在阴离子多聚物类杀微生物剂存在下,PAP248-286或精液促进克隆病毒NL4-3(X4型病毒)和81A(R5型病毒)感染活性的影响。　　 结果:　　 1.通过硫磺素T染色法,刚果红染色法,圆二色谱法,透射电镜法,本研究所包括的阴离子多聚物杀微生物剂都能普遍加速PAP248-286多肽形成淀粉样纤维的过程,并且这种促进作用呈量效关系。阴离子多聚物杀微生物剂促进PAP248-286多肽形成淀粉样纤维是通过促进其β-片层结构的形成。　　 2.通过酸性凝胶电泳法、Western blot及ELISA,我们证明了阴离子多聚物杀微生物剂与多肽PAP248-286能够相互作用,通过采用其它天然阴离子多聚物拮抗聚合的实验,证明这种结合是通过静电吸引力相互作用的。　　 3.在PAP248-286或精液存在下,各阴离子多聚物杀微生物剂抗实验株病毒ⅢB或BaL病毒的感染活性下降了8～20倍。　　 4.在各阴离子多聚物杀微生物剂存在下,PAP248-286形成的淀粉样纤维与精液的沉淀部分都能促进病毒的感染。　　 结论:　　 1.本研究表明,阴离子多聚物杀微生物剂与精液蛋白能相互作用。这种相互作用体现的药物抗病毒活性的下降可总结为以下两个原因。其一,药物与宿主蛋白相互作用,降低了游离药物的浓度,使得药物抗病毒效果下降；其二,阴离子多聚物杀微生物剂与精液来源病毒增强因子的相关多肽相互作用,加速这些多肽的聚合并形成淀粉样纤维,从而增加了精液中增强病毒感染的因素,进一步削弱了体系中的抗病毒活性。　　 2.本研究提示:精液作为杀微生物剂研究的重要媒介,应给予足够的重视。比如在临床前研究阶段,杀微生物剂在精液中的抗病毒药效评价应作为一个常规指标。又如在动物实验中,攻毒应该在精液环境中,而不是PBS溶液里。最后,鉴于精液中含有大量正电荷的多肽/蛋白质,提示了负电荷类的小分子化合物、多肽、抗体等,可能不适合于开发成杀微生物剂。因为这些负电荷的药物容易跟精液中正电荷蛋白相互作用,降低了自由药物分子的浓度,从而降低了药物的抗病毒活性。