背景:未分级肝素（Unfractionated heparin,UFH）是一种平均分子量在15～19kDa的阴离子多糖,主要用于术中全身抗凝和预防血栓形成。但UFH的使用往往伴随着出血以及其他不良反应的风险。硫酸鱼精蛋白（Protamine sulfate,PS）是一种分子量在4000～6000 Da的阳离子蛋白混合物,是临床上唯一被批准的肝素拮抗剂。PS主要从野生鲑鱼类物种的精子中提取,这种阳离子蛋白与阴离子的肝素相结合,形成UFH-PS复合物,从而使肝素失去活性。但是PS在临床应用中存在诸多不良反应,如全身性低血压,肺动脉高压和过敏反应等。虽然进行了很多机制方面的探索,但PS不良反应的发生机制至今仍不清楚。加之一直没有可替代的肝素拮抗剂,所以自1939年以来PS一直被谨慎地使用。文献报道PS的轻度不良反应高达16%,而且未知的病理作用可能导致术后发病率和死亡率的升高。而且PS不良反应机制的不明确给新的肝素拮抗剂的研发也带来了挑战。文献报道,PS引起的不良反应可能是多重因素共同导致的。在临床上PS还作为长效胰岛素的赋形剂,用来延长胰岛素的作用,提高胰岛素临床用药的顺应性。因为PS的免疫原性较强,所以长期使用该剂型的糖尿病人体内往往携带PS抗体。这类患者在遇到需要大量使用PS的全身抗凝手术时容易引发PS的不良反应。本研究以PS富含精氨酸为启发,合成了一系列的多聚精氨酸小肽。前期筛选出了一种含有15个精氨酸的小肽（命名为R15）。这种小肽可以在体内外中和UFH。初步的安全性研究显示,R15具有低毒,无免疫原性的优点。R15为全合成工艺制备,不受天然来源原材料的限制,也不会含有蛙鱼中的微量杂质,质量可控。本课题旨在对R15进行进一步的研究,揭示R15潜在的毒性反应。同时相较于PS的潜在优势,为R15的进一步的成药性研发打下基础,为新型肝素拮抗剂的研究提供启发和思路。UFH的临床剂量一般为300U/kg,患者肝素化时平均肝素浓度为4U/mL,在本文中称之为治疗浓度。目的:PS作为临床上唯一批准的UFH拮抗剂,具有许多不良反应。而且PS从鱼类精子中提取,没有严格的质量标准。本研究旨在对合成多肽R15,作为潜在的PS替代物进行成药性研究。根据新药研发要求以及PS特性,本研究拟从药学研究,药效学研究,安全性研究,药物代谢动力学四个方面进行考察。其中部分药学研究和药效学研究在硕士期间已完成,本课题主要对安全性和药物代谢动力学方面进行考察。本研究除了考察R15作为UFH拮抗剂的成药性外,还希望找出PS临床不良反应可能的发生机制（PS不良反应机制至今未被明确阐释）。方法与结果:本研究的方法和结果分为以下四个方面:1.R15的质量控制本节旨在对R15进行质量控制,保证后续实验中的药物稳定可靠。本室合成了一批R15为本课题所用。使用元素分析仪对R15进行了元素分析,测得本批次的R15碳氢氧氮比例构成为:碳（34.28%）,氢（6.66%）,氧（13.01%）,氮（26.73%）。使用液相对R15进行分析,保留时间在7.077 min,色谱图中未发现其他杂质。使用TOF对R15进行了分子量测定,所测分子量为2361.4（+H）,与R15的理论分子量一致。2 R15的药效学研究本研究旨在测定R15拮抗UFH的亲和力和效价,并在动物中进行了验证,为后续的安全性实验提供合理的用药浓度和剂量。使用Biacore测定UFH与R15的亲和力。分子间亲和力结果显示与PS相同,R15与UFH的亲和力非常强,一旦相互结合就难以洗脱。UFH-PS复合物和UFH-R15复合物的解离速率平衡常数KD分别为4.80×10-11 M和6.82×10-11 M。使用三种方法（APTT法,Anti-FXa法,浊度法）检测R15和PS拮抗UFH的效价。三种方法中Anti-FXa法与浊度法所测结果相同,PS效价为150U/mg,R15效价为170 U/mg。后续研究中使用Balb/c小鼠和Wistar大鼠进行体内效价验证。结果显示R15可以在中和剂量下完全中和肝素化的大鼠和小鼠。3 R15的初步安全性研究本研究旨在探索R15的体外安全性:UFH与R15相互作用,与红细胞,血小板,纤维蛋白,补体以及大鼠血浆的影响。体内安全性:考察单次注射R15对Wistar大鼠的安全性;使用R15多次中和肝素化Balb/c小鼠的安全性;UFH-R15复合物在豚鼠体内的免疫原性。为了观察PS,R15与UFH的结合特点,分别进行了浊度实验,粒度分析和分子间亲和力测定。观察到与PS的结合相同,UFH和R15结合后形成聚集物,使得光密度降低,且成浓度依赖性。粒径分析同浊度实验结果一致,随着R15浓度的增加,复合物的粒度也逐渐增大,达到临界值时复合物形成大的团块,进行沉积。本研究考察了 R15对红细胞的影响。在溶血实验中,发现PS和R15在高浓度下（5000 μg/mL）不会导致红细胞溶血。在红细胞脆性实验中,发现随着PS和R15浓度的提高,对红细胞膜的影响变大,但是在治疗浓度范围内没有发现红细胞膜的形变。显微镜下观察R15对红细胞聚集的影响,发现无论PS还是R15,超过500 μg/mL浓度时红细胞具有聚集的趋势,超过500 μg/mL后红细胞发生明显聚集,且成团块状。为了进一步研究R15在500 μg/mL以下对RBC是否有聚集,使用流变仪对R15处理的大鼠全血进行了测定分析,并未检测到红细胞聚集。本研究考察了 R15对血小板聚集的影响,结果显示在10倍治疗浓度下,PS和R15对血小板的聚集能力没有影响。本研究考察了 R15对血浆纤维蛋白的影响。随着浓度的增高,PS和R15都可以加快纤维蛋白原转化为纤维蛋白,且呈浓度依赖性。对PS和R15孵育过的纤维蛋白丝进行显微观察,发现PS和R15在高浓度下（4倍和10倍治疗浓度）增加了纤维蛋白的直径,使光滑的纤维蛋白丝变的粗糙。但在全血基质中这种现象变的不明显。本研究考察了 R15对补体的激活能力。发现UFH,PS和R15都可以激活补体,且激活能力为UFH＞R15＞PS。如果PS,R15分别和UFH形成UFH-PS复合物,UFH-R15复合物,则UFH,PS和R15激活补体的能力消失。但如果UFH加入过量,形成UFH过量的UFH-PS复合物,或UFH过量的UFH-R15复合物,则补体激活的能力被大大提升。甚至在非常低的浓度（1/20的治疗浓度）下,UFH-PS复合物也可以激活补体。这种肝素过量时复合物激活补体的现象也出现在UFH-R15复合物中,但UFH-R15复合物（UFH过量）的补体激活能力弱于UFH-PS复合物,大约为UFH-PS复合物（UFH过量）补体激活能力的1/7～1/8。本研究考察了 R15对大鼠血浆凝血功能的影响,发现PS和R15的加入都可以使大鼠血浆的APTT值升高。而随着孵育时间的延长,R15可以在血浆中逐步降解,使得APTT值恢复正常,而PS在2 h内未见APTT的明显变化,说明PS 比R15在血浆中稳定。为了进一步探究R15在血浆中的降解行为,使用APTT法和Anti-FXa法测定UFH-PS复合物和UFH-R15复合物在血浆中的稳定性。发现随着孵育时间的延长,UFH-R15复合物逐渐释放出UFH,使得血浆APTT升高,而UFH-PS复合物在4 h内未观察到明显的UFH的释出。考虑到临床使用中可能的肝素重新释放现象,在整体动物研究中,使用R15中和肝素化大鼠（300 U/kg,1000 U/kg）,并在4 h内监控是否有肝素释放的现象。实验结果显示R15可以完全中和UFH,且4h内并未观察到明显的肝素释放。这种体内外结果的不一致,可能与机体同时对肝素的分解和排泄有关。本课题研究了单次注射R15于正常大鼠或肝素化大鼠的毒性实验（剂量:900 U/kg）。发现PS和R15注射正常大鼠,可以引起肌酐（creatinine,CREA）的升高,影响肾脏功能。而在肝素化大鼠中,注射PS和R15也引起肌酐的增加,但与对照组相比无统计学差异。而各组的补体水平,凝血功能和组织器官等均未见明显改变。本课题研究了 R15多次给药于肝素化小鼠的毒性实验（剂量:300U/kg;共5次,每周1次）。使用R15拮抗肝素化小鼠后1h进行血常规检查（共3次,每隔1周）,未发现明显的血常规异常（观察到一次轻微的RBC降低）。给药完毕后1周,进行血常规检查,所有小鼠血常规参数均正常。研究周期内,无论使用PS还是R15中和UFH,各组小鼠均无抗体产生。本课题考察了 UFH-PS复合物和UFH-R15复合物在豚鼠体内的免疫原性,发现UFH-PS复合物处理组出现明显的免疫原性,12只中8只出现了抗体。而UFH-R15复合物免疫的豚鼠没有出现抗体。4 PS及R15药物代谢动力学研究方法的建立及大鼠体内药代动力学特征本节旨在建立PS和R15体内生物检测方法,并考察了其方法学,测定PS和R15在大鼠的药物代谢动力学参数。本方法可以监测动物体内某时刻的肝素拮抗能力。因为PS和R15在机体内均容易代谢,代谢的片段仍具有肝素拮抗活性,所以此方法非常适用。本课题考察了 1个剂量的PS（300 U/kg）和3个剂量的R15（300U/kg,900U/kg,2700U/kg）单次静脉注射大鼠后体内药物浓度随时间的变化。研究发现PS在体内快速的被清除,注射后1分钟的血药浓度为12.67±1.96μg·mL-1。平均半衰期（T1/2）为3.94±3.08 min。PS的半衰期较短,在体内易被代谢或排泄。表观分布容积（Vz）为268±151 mL·kg-1,大于大鼠血液体积（70mL·kg-1）提示可能分布在细胞外液。消除速率（CL）为53.65±11.49 mL·min-1·kg-1,说明PS在体内极易被消除;血药浓度-时间曲线下面积（AUClast）为35.89±7.07min·μg·mL-1。R15在大鼠的体内药代参数显示,R15的给药剂量分别为:300U/kg,900U/kg,2700U/kg,比例为 1:3:9。平均消除半衰期（T1/2）分别为:51.93 min,91.13 min,163.12min,比例为1:1.8:3.1。显示为非线性药物代谢动力学,药物的消除半衰期随着给药浓度的增加而减少。平均Cmax为:10.89 μg/mL,11.54 μg/mL,11.65μg/mL,比例为1:1.1:1.1。提示药物给予体内后会迅速与血液中物质结合,作为储库缓慢释放。平均曲线下面积（AUClast）为:632 min·μg·mL-1,1030 min·μg·mL-1,1320 min·μg·mL-1,比例为1:1.6:2.1,不成线性。平均表观分布容积（Vz）为:194 mL·kg-1,608 mL·kg-1,2618 mL·kg-1,比例为 1:3.1:13.5,不成线性。消除速率（CL）为:2.73 mL·min-1·kg-1,4.72 mL·min-1·kg-1,11.16 mL·min-1·kg-1,比例为1:1.7:4.1,不成线性。结论:本研究通过体内外系列方法及与PS的对比性研究,对新型肝素拮抗剂R15的安全性和有效性进行了深入探索。研究表明:R15与PS相比,与UFH的亲和常数,效价相似,均可以与UFH进行紧密结合。在治疗浓度下,PS和R15均不会对红细胞,血小板,纤维蛋白产生影响,也不会对所测试动物的凝血功能,器官及其功能产生长期影响。本研究发现了从未报道过的补体激活现象:在1/20的治疗浓度及以上时,UFH-PS复合物在UFH过量时发生补体激活,而R15虽也有此现象,但所需浓度更高（R15 半数激活浓度/PS半数激活浓度=7.78）。R15与PS相比无免疫原性,提高了 R15的用药安全。在相同剂量下,R15在大鼠体内半衰期比PS长,且没有观察到肝素重新释放的现象。总之,根据目前的实验结果,R15比PS安全性更好,非常可能成为PS替代物。同时,本研究为R15的进一步开发奠定了扎实的数据及理论支撑,为后续鱼精蛋白类似物的开发提供了方法学的探索。