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目的：乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤，严重危害着女性的生命和健康。近年来我国乳腺癌的发病率持续上升,且呈低龄化趋势。乳腺癌是典型的激素依赖性肿瘤，长期以来，以他莫西芬（tamoxifen, TAM）为代表的内分泌治疗凭借其低毒、经济，效应作用持久成为雌激素受体（estrogen receptor, ER）阳性乳腺癌患者综合治疗中最重要的治疗手段之一。然而，目前临床上约40%ER阳性乳腺癌患者对抗雌激素治疗产生耐药，具体机制尚不明确。因此，对于乳腺癌相关基因及其在TAM耐药发生机制中的研究成为乳腺癌研究的热点问题。有研究表明，在ER阳性的乳腺癌中，配对盒基因（paired box gene-2，PAX2）和乳腺癌扩增因子（amplified in breast cancer-1, AIB1）能够在TAM治疗过程中调控人类表皮生长因子受体（human epidermal growth factorreceptor-2, HER-2）基因的转录水平，进而调控HER-2的蛋白表达，该机制有可能是ER阳性乳腺癌TAM治疗耐药的重要原因之一。为揭示ER阳性乳腺癌患者TAM耐药的作用机制及相关影响因素，本课题首先应用免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶（streptavidin peroxdaseconjugated method, S-P）法检测术后ER阳性并接受正规TAM治疗的乳腺癌患者标本中PAX2和AIB1的蛋白表达，结合随访结果，回顾性分析两者的表达强度对ER阳性乳腺癌患者TAM疗效的影响;其次采用逆转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR）技术和免疫组织化学S-P法分别从转录水平和蛋白水平检测PAX2和AIB1在ER阳性乳腺癌患者中乳腺癌组织及乳腺非肿瘤组织的表达情况，分析乳腺癌组织中PAX2和AIB1的表达与其临床生物学行为及ER、孕激素受体PR（progesterone receptor, PR）、HER-2表达的关系，以进一步确定PAX2、AIB1是否为判断ER阳性乳腺癌患者抗雌激素治疗效果的敏感指标。为了进一步研究PAX2和AIB1在ER阳性乳腺癌患者抗雌激素治疗中的作用机制，本课题应用RT-PCR法检测ER阳性和ER阴性乳腺癌细胞系在雌激素刺激下PAX2、AIB1及HER-2的表达，以及TAM敏感和TAM耐药乳腺癌细胞系在TAM作用下PAX2、AIB1及HER-2的表达情况；采用siRNA技术和质粒转染技术分别对TAM敏感乳腺癌细胞系和TAM耐药乳腺癌细胞系进行对应的PAX2、AIB1基因沉默及基因过表达，并分析HER-2及相应蛋白的表达情况以明确ER阳性乳腺癌组织中PAX2，AIB1对HER-2表达的调控作用，为合理解释ER阳性乳腺癌患者TAM耐药提供依据。方法：1采用免疫组化S-P法检测167例ER阳性TAM规范治疗且资料完整的乳腺癌患者中PAX2和AIB1蛋白表达，分析两者的表达强度、及与TAM治疗后复发或转移的关系，以明确其对ER阳性乳腺癌患者TAM疗效的影响。2采用RT-PCR技术和免疫组化S-P法分别从转录水平和蛋白水平检测70例ER阳性乳腺癌组织和乳腺非肿瘤组织中PAX2和AIB1的表达情况，分析它们与乳腺癌患者年龄、绝经情况、肿物大小、病理学类型、临床分期、组织学分级、腋淋巴结转移状况、ER、PR等临床生物学行为的关系，尤其分析两基因之间及其与HER-2蛋白表达的关系，进一步确定PAX2、AIB1是否为判断ER阳性乳腺癌患者抗雌激素治疗效果的敏感指标及其是否通过HER-2的表达进行调节。3采用RT-PCR技术从mRNA水平检测雌激素刺激ER阳性乳腺癌细胞系MCF-7和ER阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231前后细胞内PAX2，AIB1，HER-2的表达及细胞增殖情况；1‰的无水乙醇和1μM TAM作用于ER阳性TAM敏感乳腺癌细胞系MCF-7和TAM耐药乳腺癌细胞系MCF-7/TAMR24小时后用Weston blot检测，以获得TAM敏感及耐药乳腺癌细胞系中PAX2和AIB1及HER-2基因的基础蛋白表达状况。4应用siRNA技术分别将PAX2siRNA转染至MCF-7，AIB1siRNA转染至MCF-7/TAMR细胞中，观察沉默PAX2和AIB1两基因后HER-2及相关蛋白的表达和细胞增殖的情况；反之应用质粒转染技术分别将PAX2质粒转染至MCF-7/TAMR，AIB1质粒转染至MCF-7细胞中，观察上调PAX2、AIB1两基因后HER-2及相关蛋白表达和细胞增殖的情况。结果：第一部分：PAX2和AIB1蛋白表达与ER阳性乳腺癌患者TAM耐药关系的研究1随访结果：167例ER阳性、术后接受TAM规范治疗的乳腺癌患者5年内无瘤生存共110例；术后5年内出现局部复发或远位转移共57例，平均无病生存期（disease-free survival, DFS）45个月，平均总生存期（overallsurvival, OS）57个月。2PAX2和AIB1蛋白表达强度在不同HER-2蛋白表达水平组间（低表达组和高表达组）有统计学差异（χ2=8.401, p=0.004；χ2=12.398，p=0.000），提示：HER-2过表达组中，PAX2蛋白表达率较低，而AIB1蛋白表达率较高。3乳腺癌患者术后复发转移状况与PAX2、AIB1蛋白表达的关系：167例ER阳性行TAM治疗的乳腺癌患者中，5年内出现复发转移患者的PAX2蛋白表达较低，而AIB1蛋白表达较高，且差异有统计学意义（χ2=4.198, p=0.040; χ2=5.336, p=0.021），提示：PAX2高表达及AIB1低表达患者复发转移率较低，是较好的预测TAM疗效的指标。第二部分：PAX2、AIB1在乳腺癌组织中的表达及其与乳腺癌临床特性关系的研究1乳腺癌组织和乳腺非肿瘤组织中PAX2和AIB1基因mRNA水平的表达各70例乳腺癌组织中的AIB1mRNA测值1.7390±0.7687高于乳腺非肿瘤组织中的测值1.2742±0.6836，二者差异有统计学意义（Z=-2.031，p=0.030），而两种组织中PAX2mRNA的差异无统计学意义（Z=-0.184，p=0.830）。2PAX2, AIB1的mRNA和蛋白表达与临床资料的相关分析分别按患者年龄（≤50岁/＞50岁）、月经状况（绝经/未绝经）、肿瘤大小（≤2cm/＞2cm组）、临床分期（Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ期）、病理学类型、组织学分级（ⅠⅡ/Ⅲ级）及腋窝淋巴结转移状况（0个/13个/＞3个）对70例乳腺癌患者的PAX2,AIB1基因表达进行分层分析，发现PAX2mRNA和蛋白表达的高低与乳腺癌患者上述临床因素无关（p＞0.05），而AIB1mRNA表达与组织学分级和腋窝淋巴结转移状况有关，AIB1蛋白表达仅与腋窝淋巴结转移状况有关，组间差异有统计学意义，与其它临床因素无关。3PAX2, AIB1mRNA和蛋白表达与HER-2，ER，PR表达的关系HER-2（-）患者19例，HER-2（+）++患者32例和HER-2（+++）患者19例，各组间PAX2mRNA和蛋白表达随着乳腺癌患者HER-2蛋白的高表达而减低，差异有统计学意义（p=0.037; χ2=7.614, p=0.022），而不同HER-2水平AIB1mRNA差异无统计学意义（p=0.054）, AIB1的蛋白表达却随着HER-2蛋白的增高而增高，差异有统计学意义（χ2=11.564，p=0.003）。ER（+）++乳腺癌患者32例，ER（+++）乳腺癌患者38例, PR（-）++乳腺癌患者46例, PR（+++）乳腺癌患者24例，统计学分析后发现不同ER/PR表达水平的乳腺癌患者中PAX2和AIB1的基因和蛋白表达均无统计学差异（p>0.05）。4PAX2与AIB1蛋白表达的关系53例AIB1（-）++的乳腺癌患者中PAX2高表达者19例，其高表达率为35.85%;17例AIB1（+++）的乳腺癌患者中PAX2高表达者1例，其高表达率为5.88%，不同AIB1蛋白表达水平间PAX2的蛋白表达差异有统计学意义，且随着AIB1表达的增加PAX2表达减低，二者呈负相关（χ2=5.664，p=0.017；r=-0.306）。5随访结果：70例患者中失访12例，复发或转移6例，其中死亡3例，OS平均为46个月，DFS为44个月。随访资料完整的58例患者中，26例规范应用TAM治疗，转移2例，其中1例死亡，OS平均为46.5个月，DFS平均为46.7个月。而26例TAM治疗患者中AIB1高表达9例，其中转移2例，转移率为22.22%；AIB1低表达17例均无转移，提示AIB1高表达患者的复发转移风险高（χ2=4.093，p=0.043）。第三部分：PAX2和AIB1表达与乳腺癌TAM治疗耐药机制的实验研究1雌激素刺激ER阳性乳腺癌细胞系MCF-7后，PAX2的mRNA表达水平与刺激前相比显著降低，AIB1及HER-2反之；而雌激素刺激ER阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231后PAX2、AIB1、HER-2的mRNA表达水平与刺激前相比未见明显变化。提示：PAX2和AIB1参与了HER-2相关的雌激素依赖性传导通路，乳腺癌细胞增殖过程伴随着PAX2的mRNA表达率降低和AIB1及HER-2的mRNA表达水平的提高。2在TAM敏感型乳腺癌细胞系MCF-7和TAM耐药型乳腺癌细胞系MCF-7/TAMR中，均可检测到PAX2、AIB1及HER-2的蛋白表达，二种细胞中AIB1蛋白表达差异无统计学意义，MCF-7细胞中PAX2蛋白表达量较MCF-7/TAMR细胞低，而HER-2蛋白表达反之，差异有统计学意义（p＜0.05）。提示：TAM耐药的原因可能与PAX2和HER-2的表达相关。TAM刺激MCF-7细胞后AIB1表达显著升高而PAX2、HER2表达降低，差异有统计学意义（p＜0.05）。而TAM刺激MCF-7/TAMR细胞后PAX2、AIB1蛋白表达变化无意义，仅HER-2蛋白表达升高，差异具有统计学意义（p＜0.05）。3PAX2siRNA转染MCF-7细胞,AIB1siRNA转染MCF-7/TAMR细胞MCF-7细胞系转染PAX2siRNA后显示，PAX2siRNA+TAM处理组MCF-7细胞中HER-2mRNA表达和蛋白表达水平比PAX2siRNA+Vehicle处理组明显增加，而AIB1的蛋白表达降低（p<0.05），而细胞增殖活性则无明显抑制。提示PAX2基因的沉默会阻碍TAM对HER-2表达和细胞增殖的抑制，使HER-2转录和蛋白表达增加，而且PAX2表达的降低，逆转了TAM对AIB1上调作用。MCF-7/TAMR细胞系转染AIB1siRNA后显示，AIB1siRNA+TAM处理组MCF-7/TAMR细胞中HER-2的mRNA表达和蛋白表达水平比AIB1siRNA+Vehicle处理组降低，并且PAX2蛋白表达水平和细胞增殖活性也明显降低（p＜0.05），结果提示，MCF-7/TAMR细胞中沉默AIB1恢复了TAM下调HER-2转录和HER-2蛋白表达的作用，AIB1的高表达可能抑制乳腺癌细胞TAM的抗雌激素活性。4PAX2质粒扩增至MCF-7/TAMR细胞，AIB1质粒扩增至MCF-7细胞MCF-7/TAMR细胞系转染PAX2质粒后显示PAX2质粒+TAM处理组与空载质粒+TAM处理组相比MCF-7/TAMR细胞中HER-2mRNA表达水平和蛋白表达水平明显减低，AIB1蛋白的相对表达量减少，细胞增殖活性降低（p<0.05）。提示：PAX2表达的增加逆转了TAM对MCF-7/TAMR细胞HER2蛋白表达的促进作用，使其恢复对TAM的敏感性，增加PAX2可以逆转TAM耐药状况。MCF-7细胞系转染AIB1质粒后，AIB1质粒+TAM处理组较AIB1质粒+Vehicle组MCF-7细胞中HER-2mRNA表达水平和蛋白表达水平明显增高，细胞增殖活性明显增高而PAX2蛋白表达水平降低（p<0.05），提示：AIB1表达升高并未改变TAM抑制PAX2表达的作用，但上调AIB1逆转了MCF-7细胞中TAM对HER2的抑制作用，使细胞增殖活性增加，AIB1表达增高引起TAM耐药。结论：1在ER阳性的乳腺癌患者中，PAX2蛋白高表达AIB1蛋白低表达患者5年内复发转移率较低，是较好的预测预后的指标；PAX2蛋白高表达在HER-2蛋白过表达组中较低，而AIB1蛋白高表达在HER-2蛋白过表达组中较高，提示PAX2,AIB1与HER-2过表达及TAM治疗耐药相关。2PAX2基因在乳腺癌组织与乳腺非肿瘤组织之间表达无差异，PAX2mRNA及蛋白表达与年龄、月经状况、肿瘤大小、临床分期、组织学分级、腋窝淋巴结转移、病理类型、ER/PR表达水平均无显著相关性。3乳腺癌组织中AIB1基因表达高于乳腺非肿瘤组织，AIB1mRNA表达与组织学分级、腋窝淋巴结转移情况正相关，而AIB1蛋白表达仅与腋窝淋巴结转移情况正相关，与年龄、月经状况、肿瘤大小、临床分期、病理类型、ER/PR表达水平均无显著相关性。4PAX2，AIB1在ER阳性的乳腺癌细胞中均表达，在HER-2高表达的TAM耐药株中PAX2表达较TAM敏感的细胞株低，而二者AIB1表达水平相当。PAX2过表达增加乳腺癌细胞对TAM的敏感性，AIB1过表达则减低了其敏感性；预示了PAX2和AIB1可能作为乳腺癌内分泌治疗耐药的预测指标。5PAX2是TAM治疗过程中HER-2的转录抑制因子，针对PAX2的特异激活剂有望成为乳腺癌内分泌治疗耐药的新靶点。AIB1与PAX2相互调节，并可能通过竞争性结合HER-2上游的调节因子，调控HER-2的转录，从而影响雌激素受体阳性乳腺癌TAM治疗的敏感性。6PAX2表达的增强及AIB1表达的降低均有助于改善TAM耐药状态，PAX2和AIB1有望成为TAM耐药患者新的基因治疗靶点。