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颗粒溶素(Granulysin，GNLY)和颗粒酶（Granzyme，Gzm）都是由细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocypes，CTLs)和自然杀伤(nature killer, NK)细胞合成分泌的天然免疫分子。前者在人类具有9和15kD两种形式，9kD颗粒溶素可直接溶解病原菌和多种寄生原虫及肿瘤细胞;后者是一类丝氨酸蛋白酶(Serine protease)，可在GNLY和/或穿孔素(perforin)协同下进入被病原体感染的靶细胞和肿瘤细胞，诱导caspase非依赖性/依赖性的凋亡机制而杀死/清除被感染细胞和肿瘤细胞。基因组数据库分析表明，鸡具有编码GNLY和Gzms的基因。为研究二者在抗球虫天然免疫中的作用，本研究克隆和重组表达了鸡的颗粒溶素及颗粒酶A、K，并对颗粒溶素的活性分析方法、颗粒酶的酶动力学特征等进行了初步研究。主要研究内容和结果如下: 1.PCR克隆得到了ChGzmA和ChGzm K基因的成熟编码序列，并通过生物信息软件对ChGzmA和ChGzmK序列进行了初步分析。测序结果显示克隆的ChGzmA基因长783 bp，编码260个氨基酸，分子量大小约为26 kD;克隆的ChGzmK基因长789 bp，编码262个氨基酸，分子量大小约为27 kD。构建了pET26b-ChGzmA和pET26b-ChGzmK原核表达载体，并将重组质粒转化入表达菌BL21(DE3)中，经由终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导后，成功获得了pET26b-ChGzmA和pET26b-ChGzmK融合蛋白的可溶性表达。纯化后进行酶动力学分析，结果表明ChGzmA可水解Suc-VANR-pNA，其Km=0.0250±0.00086μM，Vmax=122.96±8.49μM/min/μg;ChGzmK可水解Ac-YRFK-pNA，其Km=0.0083±0.00061μM，Vmax=22.225±5.3832μM/min/μg;ChGzmA和ChGzmK的活性均可被D-Phe-Pro-Arg-CMK抑制，IC50值分别为16.62±1.0629μM和25.464±1.7731μM。 2.采用实时定量PCR检测并以相对定量法计算GzmA、GzmK、GzmM和GzmG-like的mRNA在球虫感染后鸡盲肠扁桃体中不同时期转录量的差值，并选取鸡GAPDH作为内参基因。结果显示，未感染球虫组、一次感染球虫组和二次感染球虫组鸡盲肠扁桃体中4种颗粒酶的mRNA转录量没有显著差异。 3.用SMART在线工具对鸡颗粒溶素编码基因进行结构域预测，PCR克隆得到了ChGNLY的成熟编码序列，并通过生物信息软件对ChGNLY序列进行了初步分析。测序结果显示克隆的ChGNLY基因长240 bp，编码79个氨基酸，分子量大小约为36 kD。构建pGEX-6p-1-ChGNLY原核表达载体，并将重组质粒转化入表达菌BL21中，经由终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导后，成功获得了ChGNLY融合蛋白的可溶性表达。纯化后利用CellTiter-Glo(@)2.0 Assay检测ChGNLY的生物学活性，结果表明rChGNLY对MDBK细胞具有细胞毒性，且该细胞毒性呈剂量依赖性。 这些初步结果为进一步研究颗粒酶的抗球虫杀伤机理奠定实验基础。