论文部分内容阅读
卵巢是雌性哺乳动物重要的生殖器官和内分泌腺体，卵巢的功能由其基本结构单位卵泡实现，而卵泡的发育依赖于卵母细胞及颗粒细胞的相互作用。在小鼠中原始卵泡的形成起始于胚胎17.5天。为了大规模筛选哪些基因参与原始卵泡形成，我们建立了胎鼠及新生鼠卵巢体外培养的新方法，在此基础上利用电转有效实现了原始卵泡形成相关基因的功能验证，并且在原始卵泡无法形成的基因敲除鼠中恢复了原始卵泡的形成。
首先我们构建并优化了一种简易的胎鼠及新生鼠卵巢体外琼脂糖培养体系，发现用该体系能模拟小鼠卵巢。利用该培养体系，以pcDNA3.0-H2B-GFP和FAM-non-targetingsiRNAs分别作为质粒和小RNA电转的marker转染培养的卵巢，组合不同电转参数，筛选出了胎鼠及新生鼠卵巢质粒和小RNA电转的最优电转参数，分别为27v，10ms，1000msinterval，10pulse和27v，10ms，1000msinterval，5pulse，正反一次电场。在此基础上验证了电转系统的安全性，证明电转并不影响卵泡的正常发育。随后对质粒和小RNA电转的效率进行了确认，发现卵巢中质粒电转效率可达到约32.80±2.91％，小RNA的电转效率可达到40％-54％。接下来对电转体系基因过表达及敲减的效果进行了表型验证。对胚胎18.5天的胎鼠卵巢体外培养并电转pcDNA3.1-GDF9-CyclinD1质粒，导致原始卵泡数目的显著下降，这与在CyclinD1过表达的转基因鼠中观察到的表型一致，说明电转体系可有效介导外源基因超表达。另一方面，通过电转PCNAsiRNAs对新生小鼠卵巢PCNA进行敲减，导致原始卵泡数目增多、原始卵泡启动发育受阻。最后，通过电转对FIGa基因敲除鼠进行了FIGa超表达，恢复了敲除鼠原始卵泡不能形成的表型。以上工作表明了胎鼠及新生鼠卵巢体外培养及电转的可行性。该研究首次尝试将电转应用于胎鼠及新生鼠卵巢发育相关基因过表达和敲减的研究，为探讨原始卵泡形成的基因调控提供了新方法。