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前言多种原因,如腹主动脉瘤手术、四肢大血管栓塞或损伤、高位肢体离断、严重肢体挤压伤、断肢再植及肢体手术长时间应用止血带等均可造成肢体缺血。恢复充足的血供乃缺血组织成活的关键,然而缺血组织再灌注损伤不仅存在于缺血组织,尚可进一步导致其他远隔器官的损伤,甚至多器官功能障碍(MODS)。肺脏作为最易受损的器官之一,若损伤严重,则可导致急性呼吸窘迫综合征(ARDS),但目前对其发生机制尚未完全阐明。羟甲基戊二酰辅酶A(HMGCoA)还原酶抑制剂又称他汀类药物,此类药物通过竞争性抑制内源性胆固醇合成限速酶HMGCoA还原酶,使血清胆固醇清除增加,水平降低。辛伐他汀作为他汀类降脂药的一种,除具有传统的降脂作用外,其非降脂作用亦成为研究热点。研究表明,辛伐他汀可减轻心、脑等脏器的缺血再灌注损伤,但对肢体缺血再灌注肺损伤的影响尚不清楚。基于上述原因,本实验拟通过大鼠肢体缺血再灌注肺损伤模型,研究辛伐他汀预处理对大鼠肢体缺血再灌注肺损伤的影响及机制,为临床应用其预防治疗肺损伤提供理论依据。本实验分三个部分,包括:一、辛伐他汀预处理对大鼠肢体缺血再灌注肺损伤的影响;二、辛伐他汀预处理对肢体缺血再灌注肺损伤大鼠氧自由基和一氧化氮(NO)的影响;三、辛伐他汀预处理对肢体缺血再灌注肺损伤大鼠血红素氧合酶—1(HO-1)的影响。材料与方法一、实验材料(一)实验动物健康雄性SD大鼠144只,体重250~300g,由中国医科大学实验动物中心提供。(二)实验仪器PCR扩增仪(Biometra,德国);DYY-6B型电泳仪(北京六一仪表厂,中国);AE-240型电子天平(Mettler,日本);722型分光光度计(上海分析仪器厂,中国);3K15型高速离心机(Sigma,德国);UV-300型紫外分光光度计(Unicam,美国);OT-701型输液泵(JMS,德国);Gem Premier 3000型血气分析仪(IL,美国);ES-1000 SPM型超声血流仪(Hayashi Denki,日本);凝胶成像系统(Kodak,美国);BX-41型显微摄像系统(Olympus,日本);Scion Image图像分析系统(Apple,美国)。(三)实验试剂及药品辛伐他汀(Merck Sharp&Dohme,英国);NO、NOS、MDA、SOD、MPO及考马斯亮蓝蛋白检测试剂盒(南京建成生物工程研究所,中国);Trizol试剂盒(Invitrogen,美国);DNA Marker、RT-PCR试剂盒及引物合成(TaKaRa,日本);山羊血红素氧合酶—1(HO-1)、兔内皮型NOS(eNOS)及兔诱导型NOS(iNOS)多克隆抗体(Santa cruz,美国);碱性磷酸酶标记的兔抗山羊及山羊抗兔IgG抗体(Chemicon,美国);戊巴比妥钠(上海化学试剂采购供应站,中国)。二、实验方法(一)实验一SD大鼠48只,随机分为6组(n=8):假手术组(C组)、肢体缺血再灌注组(IR组)、辛伐他汀1、5、10mg·kg-1·d-1预处理组(S1组、S5组、S10组)和辛伐他汀对照组(S组)。C组和IR组每日清晨1ml蒸馏水灌胃1次,连续3d;S1组、S5组、S10组和S组分别于每日清晨将1、5、10、10 mg·kg-1·d-1辛伐他汀溶于1ml蒸馏水灌胃1次,连续3d。最后一次给药后2h,除C组和S组行假手术处理外,其余各组均用无创血管夹夹闭大鼠双后肢股动脉,使其缺血2h再灌注3h。再灌注末,颈动脉采血1ml行血气分析,放血处死大鼠,光镜观察肺组织病理学变化,计数肺泡和毛细血管间隙多形核中性粒细胞(PMN)数目,测定肺湿/干重比(W/D)及肺髓过氧化物酶(MPO)活性。(二)实验二SD大鼠48只,随机分为6组(n=8),分组方式及模型制作同实验一。再灌注末,放血处死大鼠,测定肺超氧化物歧化酶(SOD)和一氧化氮合酶(NOS)活性、一氧化氮(NO)和丙二醛(MDA)含量,RT-PCR和Western blot法分别检测肺组织eNOS mRNA及其蛋白和iNOS mRNA及其蛋白的表达。(三)实验三SD大鼠48只,随机分为6组(n=8),分组方式及模型制作同实验一。再灌注末,放血处死大鼠,RT-PCR和Western blot法分别检测肺组织HO-1 mRNA及其蛋白的表达。结果一、实验一C组和S组肺组织形态结构基本正常;IR组肺组织水肿,肺泡隔增宽,毛细血管扩张、充血,有大量炎性细胞浸润,有局限性肺不张;S1组、S5组、S10组肺组织损伤较IR组明显减轻,S10组只有少量渗出及肺泡隔轻度增宽。与C组比较,IR组动脉血氧分压(PO2)及二氧化碳分压(PCO2)降低(P<0.01);与IR组比较,S1组、S5组、S10组动脉血氧分压(PO2)及二氧化碳分压(PCO2)升高(P<0.01);各组间动脉血PH值变化无统计学差异。与C组比较,IR组、S1组、S5组肺组织PMN计数、W/D及MPO活性升高(P<0.01);与IR组比较,S1组、S5组、S10组肺组织PMN计数、W/D及MPO活性降低,且呈剂量依赖性(P<0.01)。二、实验二与C组比较,IR组、S1组、S5组肺组织MDA含量、NOS活性、NO含量升高,SOD活性降低,S10组NOS活性及NO含量升高(P<0.05或0.01);与IR组比较,S5组和S10组肺组织SOD活性、NOS活性及NO含量升高,MDA含量降低(P<0.01),S1组肺组织NOS活性及NO含量升高,MDA含量降低(P<0.01)。与C组比较,IR组、S1组、S5组eNOS mRNA及其蛋白表达减少,iNOS mRNA及其蛋白表达增加,S10组iNOS mRNA及其蛋白表达增加(P<0.01);与IR组比较,S1组、S5组、S10组eNOSmRNA及其蛋白表达增加,iNOS mRNA及其蛋白表达减少,且呈剂量依赖性(P<0.05或0.01)。三、实验三与C组比较,其余五组的HO-1 mRNA及其蛋白表达增加(P<0.01);与IR组比较,S1组、S5组、S10组HO-1 mRNA及其蛋白表达增加,且呈剂量依赖性(P<0.01)。结论一、辛伐他汀预处理剂量依赖的减轻了大鼠肢体缺血再灌注肺损伤。二、辛伐他汀预处理通过减轻肺组织炎性反应和氧化损伤以及对NO、NOS代谢的影响提供肺保护。三、辛伐他汀预处理通过增加肺组织eNOS mRNA及其蛋白表达,减少肺组织iNOS mRNA及其蛋白表达发挥肺保护作用。四、辛伐他汀预处理通过增加肺组织HO-1 mRNA及其蛋白表达对肺损伤起保护作用。