新型隐球菌性脑膜炎(Cryptococcal meningitis)是由新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)直接侵犯中枢神经系统引起的颅内感染,是临床最常见的机会性中枢神经系统真菌感染性疾病之一。本病为艾滋病患者常见的机会感染,易感人群以白血病及淋巴瘤等肿瘤患者、长期使用皮质类固醇激素及免疫抑制剂者、各种原因所致的免疫功能低下者等为主,但仍有约半数患者并无基础疾病或免疫功能缺陷的证据,目前本病有逐年增加的趋势。新型隐球菌性脑膜炎的临床表现复杂,其有疗程长(一般为3～4个月,疗效欠佳者常常超过半年)、疗效差、复发率高和病死率高的特点,是目前临床治疗的难点之一。目前国内外报道的治愈率在30%～71.4%。未经治疗的患者难以存活,即使在经过正规治疗的患者中死亡率依然高达10%～40%,尤其是合并AIDS的患者,即使在得到积极治疗的情况下,新型隐球菌性脑膜炎发病后3个月的病死率仍达20%左右,未经正规治疗的患者死亡率几乎为100%。而国外研究报道即使联合高效抗逆转录病毒等新疗法,HIV相关性的新型隐球菌性脑膜炎患者3个月病死率依然高达20%。目前国内外多项临床研究采用两性霉素B(Amphotericin B,AMB)鞘内注射联合静脉用药治疗新型隐球菌性脑膜炎,但结论不一,依然存在明显的争议。所以需进一步完善新型隐球菌性脑膜炎的治疗方案,提高治愈率、降低死亡率和大幅度缩短疗程及医疗费用,将极大地造福患者,减轻家庭及社会的负担。临床治疗新型隐球菌性脑膜炎的主要原则在于抗真菌治疗。目前抗真菌治疗主要为药物治疗,常用药物主要有AMB、5-氟胞嘧啶(5-Fluorocytosine,5-FC)、氟康唑(Fluconazol,FLU),主张联合给药。AMB作为一种重要多烯类抗真菌药,仍是目前治疗新型隐球菌性脑膜炎最有效的药物。AMB联合5-氟胞嘧啶是目前公认的治疗新型隐球菌性脑膜炎的最佳选择方案。2010年新型隐球菌诊断与治疗中国专家共识提倡诱导期应用AMB联合5口氟胞嘧啶至少要治疗8周,后续的巩固期唑类药物至少要治疗12周。但关于AMB的剂量、疗程及方法文献报道不一。目前AMB无口服制剂,且对组织刺激性大,不宜肌肉注射,所以对深部或是全身性真菌感染治疗必须予静脉滴注。AMB静脉给药时几乎所有患者均可出现不同程度的肾功能损害,如尿中可出现红细胞、白细胞、蛋白尿和管型尿,肌酐清除率降低,血尿素氮和肌酐升高,也可引起肾小管性酸中毒。AMB还存在肝毒性,可导致肝细胞坏死,急性肝功能衰竭亦有发生。AMB静脉注射的其他副作用包括寒战、高热、恶心、呕吐、头痛、贫血、低钾血症(由肾小管酸中毒所致)、血栓性静脉炎、心律紊乱、视力障碍等。AMB为浓度依赖性药物,足够的峰值药物浓度是其发挥疗效的基础。因此治疗新型隐球菌性脑膜炎时其必须在脑脊液(Cerebrolspinal fluid,CSF)中达到足够高的药物浓度才能够取得满意的疗效,但由于其透过血脑屏障的能力较差,无法在CSF中达到较高的药物浓度,因此静脉用药时CSF中的AMB药物浓度仅为血药浓度的2%～3%,即使颅内感染造成血脑屏障不同程度的破坏或是使用不同剂型的AMB,其CSF中的药物浓度仍不能明显增高,大多不超过4%,甚至测不出,从而无法达到最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)。也有许多临床医生通过鞘内注射AMB以提高CSF内的药物浓度和直接杀灭隐球菌而提高疗效,AMB鞘内给药可以弥补其静脉给药难以透过血脑屏障的缺陷,但是鞘内注射AMB可引起神经系统毒性反应,包括严重头痛、发热、呕吐、颈项强直、下肢疼痛及尿潴留等,严重者可发生下肢截瘫。鞘内注射AMB的毒副作用限制了其广泛的临床应用本课题组首次报道AMB椎管内持续给药的新疗法。我们的研究结果显示,AMB椎管内持续给药使AMB在CSF中的药物浓度显著提高并能持续维持在一个稳定有效的水平(T>MIC),且常规静脉给药及鞘内注射中常见的AMB毒性及其它副作用明显降低。AMB椎管内持续给药可以弥补静脉给药及常规鞘内给药两者的不足。具有以下优点：首先,腰大池置管后椎管内持续给药可以任意控制给药的持续时间和给药间隔,并持续维持稳定的药物浓度,避免出现过高的药物峰值浓度,减轻神经系统毒性反应；其次,在持续稳定的药物浓度之下,较长的注射时间可以注入较大剂量的AMB,对控制感染有利。足够高的药物浓度对AMB抗菌作用的发挥至关重要,同时AMB有明显的神经系统毒性,其安全浓度范围也较低,所以必须将药物浓度维持在最低抑菌浓度与安全浓度之间,这是静脉注射及常规鞘内给药难以实现的。本课题组已在人体和兔研究了椎管内持续注射AMB在CSF中的药代动力学。我们通过对比AMB在兔持续椎管内给药及常规鞘内注射给药的CSF中药物浓度曲线研究AMB在CSF中的药代动力学,具有显著药动学差异,并得出AMB持续椎管内给药及常规鞘注的推荐剂量,即兔按AMB0.15mg/kg/d的剂量持续椎管内注射,相当于70kg成年人中常规鞘内注射4mg/d的剂量；兔按0.015mg/kg的剂量常规鞘内注射,等同于在70kg成年男性中常规鞘注1mg/次的剂量。而上述研究中关于AMB椎管内持续给药的安全性评价尚不明确。所以在本研究中,本课题组通过急性毒性动物实验对AMB持续椎管内给药进行安全性评价,为AMB椎管内持续给药的临床应用提供进一步依据。目的本研究拟采用我们成功制备的兔椎管内腰大池置管模型,通过不同剂量组的急性毒性试验探讨AMB椎管内持续给药和鞘内给药的安全性评价。方法1、实验动物与分组新西兰白兔108只,体重2.0～2.5kg,雌雄各半,随机分成2个实验组(持续给药实验组和鞘内注射实验组)和2个对照组(持续给药对照组和鞘内给药对照组),2个实验组共分为7个亚组：①持续给药实验组4组(推荐剂量(0.15mg/ml/kg)组、5倍推荐剂量组(0.75mg/ml/kg)、10倍推荐剂量组(1.5mg/kg)和20倍推荐剂量组(0.3mg/ml/kg)),每组各12只；②鞘内注射给药实验组3组(推荐剂量(0.015mg/ml/kg)组、5倍推荐剂量组(0.075mg/ml/kg)和10倍推荐剂量组(0.15mg/ml/kg)),每组各12只；每个对照组各12只；每个实验亚组和对照组再分成3个亚组：1天组,7天组和14天组,每组各4只。所有动物行经第2尾椎行椎管内置管。每个实验组的亚组采用相应的鞘内给药方案给予相应剂量的AMB,每个对照组采用相应的鞘内给药方案给予等量生理盐水。2、经第2尾椎椎管内置管所有新西兰白兔椎管内给药前均采用本课题组报道的经第2尾椎椎管内置管术。3、椎管内持续给药持续给药实验组各亚组(0.15mg/kg/250μl/24h.0.75mg/kg/250μl/24h、1.5mg/kg/250μl/24h、3mg/kg/250μl/24h)经椎管内导管用微量进样泵将相应剂量AMB持续注射于兔蛛网膜下腔内,持续时间为24h。持续给药对照组椎管内持续注射等量生理盐水,持续时间为24h。持续给药组给药组均在给药过程和给药后14天中对动物进行临床观察,注意有无药物神经系统毒性表现和采用改良Tarlov’s评分方法对兔运动功能进行评价,并且7天亚组和14天亚组均在给药前和给药7后天行静脉采血检查血钾和肝肾功能,其中每个剂量亚组的4只于给药1天后灌注固定取标本,4只于给药7天后灌注固定取标本,4只于给药14天后灌注取标本,其中每只留取脑、脊髓等分别进行HE、Bielschowsky神经纤维轴突染色和Luxol fast blue (LFB)髓鞘染色并在光镜观察病理变化。4、常规鞘内注射给药鞘内注射给药实验组个亚组(0.015mg/kg/250ul、0.075mg/kg/250μl、0.15mg/kg/250μl)经椎管内导管用微量进样泵将相应剂量AMB持续注射于兔蛛网膜下腔内,模拟临床鞘内注射给药方法,30min注射完毕。鞘内注射对照组椎管内持续注射等量生理盐水,持续时间为30min。鞘内注射给药对照组椎管内持续注射等量生理盐水,持续时间为24h。鞘内注射给药组均在给药过程和给药后14天中对动物进行临床观察,注意有无药物神经系统毒性表现和采用改良Tarlov’s评分方法对兔运动功能进行评价,并且7天亚组和14天亚组均在给药前和给药7后天行静脉采血检查血钾和肝肾功能,其中每个剂量亚组的4只于给药1天后灌注固定取标本,4只于给药7天后灌注固定取标本,4只于给药14天后灌注取标本,其中每只留取脑、脊髓等分别进行HE、Bielschowsky神经纤维轴突染色和Luxol fast blue (LFB)髓鞘染色并在光镜下观察病理变化。结果1、神经系统毒性反应：椎管内持续给药实验组的48只新西兰兔：在推荐量组、5倍推荐剂量组和10倍推荐量组的36(75%)相对安全,无明显膀胱功能障碍(尿潴留或尿失禁)和肢体瘫痪等神经系统毒性表现；在20倍数推荐剂量组12只新西兰兔中有9只(19%)较容易并发一侧肢体无力和肢体瘫痪等神经系统毒性表现,但为一过性表现,可完全恢复至正常。椎管内持续给药对照组均未见明显异常。常规鞘内注射组的36只新西兰兔：在推荐量组和5倍推荐量组的24只无膀胱功能障碍(尿潴留或尿失禁)和肢体瘫痪的其他神经系统毒性表现；在10倍推荐剂量组的12只新西兰兔中有10只(28%)容易并发一侧肢体无力和肢体瘫痪等神经系统毒性表现,为一过性表现,可完全恢复至正常。常规鞘内注射对照组均未见明显异常。持续给药20倍推荐剂量组和鞘内注射10倍推荐剂量组给药后第1天和第7天Tarlov’s评分降低,其它各时间点均正常。鞘内注射10倍推荐剂量组兔损伤后恢复速度较持续给药20倍推荐剂量组的慢,恢复时间也较长。说明持续给药20倍推荐剂量组兔的损伤是可逆性恢复的,且恢复较快。2、检验项目：椎管内持续给药组和鞘内注射给药组的的血液生化检验指标均在新西兰兔正常生化值范围内。3、病理染色：①HE染色：持续给药各实验组、鞘内注射各实验组以及各对照组HE染色均未见异常。②LFB髓鞘染色：持续给药和鞘内注射各实验组以及各对照组兔脑和脊髓LFB染色均未见明显的髓鞘脱失。③Bielschowsky神经纤维轴突染色：鞘内注射10推荐剂量组给药后第7天和第14天兔的脊髓的轴索染色显示轴索排列紊乱、迂曲；持续给药20倍推荐剂量组第7天兔的脊髓轴索染色也可见轴索排列紊乱、迂曲,其余各实验组及对照组兔的脑和脊髓轴索染色均未见明显异常。结论1、AMB椎管内持续给药有一个相对较宽的安全治疗剂量范围,即是0.15mg/kg～1.5mg/kg/24h。在这个范围内,无明显的毒副作用。在中毒剂量(3mg/kg/24h)时可出现神经系统毒性反应,但损害为可逆性,且恢复较快。2、AMB鞘内注射剂量安全范围较窄,为0.015/mg/kg～0.075mg/kg,在中毒剂量(0.15mg/kg)时可出现神经系统毒性反应,损害也为可逆性,但恢复较慢。3、椎管内持续给药的安全性明显高于鞘内注射。4、静脉抽血检测指标结果表明AMB椎管内给药的方式不容易导致低钾血症和肝肾功能损伤。5、AMB的神经毒性作用主要为轴索损害,为可逆性；髓鞘脱失不明显。