目的:细菌DNA是革兰阳性细菌和革兰阴性细菌共有的遗传物质,是导致全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)发生的主要致病因子之一,未甲基化的CpG序列即CpG基序(CpG motif)是细菌DNA免疫刺激的最小作用单位。Toll样受体家族的TLR9(Toll-Like Receptor 9)是巨噬细胞识别CpG DNA的模式识别受体,它可通过激活单核/吞噬细胞系统信号转导,活化NF-κB、AP-1,从而大量释放TNF-α、IL-1、IL-6和IL-12等多种前炎症细胞因子,引起急性炎症反应、SIRS甚至休克、死亡。TLR9是跨膜蛋白质,分为胞外区、跨膜区和胞内区三部分。TLR9胞外区由25个富含亮氨酸的重复序列(leucine-rich repeats,LRRs)组成,与识别CpG DNA有关。其中的LRR2、5、8、11序列后跟随有插入氨基酸序列,可能是与CpG DNA的结合位点或参与结合CpG DNA。但是,迄今为止,TLR9是如何识别CpG DNA、其识别位点在何处还不清楚,更不清楚TLR9识别CpG DNA的分子机制。因此,明确TLR9与CpG DNA的结合位点对阐明CpG DNA介导炎症的发生机制,并将其作为可能的新的药物靶点进行疾病防治具有重要意义。本课题深入分析TLR9胞外段与胞内段空间结构和生物学活性;应用细菌生长抑制实验推测LRRs在识别CpG DNA中的作用;合成LRR多肽,观察其与CpG DNA的亲合力以及生物学活性;为明确TLR9与CpG DNA结合位点、阐明TLR9识别机制奠定基础。方法:一、TLR9胞外段与CpG DNA识别、结合LRR序列的确定(一)TLR9胞外段LRR2、5、8、11序列在大肠杆菌中的表达构建含有TLR9胞外段LRR2、5、8、11序列的原核表达pET28系列载体,在大肠杆菌中IPTG诱导表达相应的蛋白。(二)利用细菌生长变化推测TLR9胞外段与CpG DNA结合位点含有TLR9胞外段LRR2、5、8、11序列的pET28和pQE30原核表达载体,转化大肠杆菌BL21感受态或M15感受态,1 mM IPTG分别诱导8h,并在第0h、2h、4h、6h、8h分别取菌液测定细菌OD600,绘制生长曲线。(三)应用生物传感器技术检测LRR多肽与CpG DNA亲和力人工合成LRR2、5、8、11多肽,将生物素标记的CpG DNA包被于生物素化样品池,利用生物传感器检测各个LRR多肽与CpG DNA的亲和力,结果以结合峰值表示。在此基础上,测量、计算LRR多肽与CpG DNA的解离常数Kd值。(四)应用细胞因子释放抑制实验观察LRRs在结合CpG DNA中的作用分离小鼠腹腔巨噬细胞,加入48孔板中,每孔5×106个细胞,培养4h,预先准备各LRR多肽与CpG DNA的混合物,加入培养孔内,继续培养4h后取培养上清,ELISA法检测TNF-α含量。(五)应用细胞内化实验观察LRRs对CpG DNA在细胞中聚集的影响分离小鼠腹腔巨噬细胞,加入24孔板中,在细胞培养体系中加入不同的6-FAM标记的CpG DNA与LRR多肽的混合物后,培养1 h,应用流式细胞术观察细胞内荧光强度的变化。对各多肽进行理论分析,计算多肽的各种理化参数,如分子量、等电点、氨基酸构成、原子组成等。二、TLR9胞内段抑菌作用的发现和实验研究(一) TLR9胞内段CT序列在大肠杆菌中的表达构建含有TLR9跨膜段、胞内段的pQE30-CT载体,转化大肠杆菌M15菌株,SDS-PAGE电泳检测目的蛋白表达,Wester-blot法进一步确定目的蛋白的特异性。(二) IPTG诱导对pQE30-CT转化细菌的生长的影响1. 1.0 mM IPTG诱导对pQE30-CT载体转化菌生长的影响扩增pQE30-CT载体转化菌至OD600为0.3左右,1 mM IPTG分别诱导8h,并在第0h、2h、4h、6h、8h分别取菌液测定细菌OD600,绘制生长曲线。2.不同浓度IPTG诱导对pQE30-CT载体转化菌生长的影响3. pQE30-CT载体不同表达宿主菌的生长变化4.不同起始诱导细菌浓度对IPTG诱导后生长的影响5.含抗生素LB培养液对M15-pQE30-CT菌株诱导后生长的影响分别使用了含双抗(氨苄青霉素和卡那霉素)LB培养液和不含双抗LB培养液,观察M15-pQE30-CT菌株经1.0 mM IPTG诱导后生长变化。6. M15-pQE30-CT菌株IPTG诱导24 h生长曲线7. M15-pQE30-CT诱导后超声上清对大肠杆菌ATCC35218生长的影响8. M15-pQE30-CT与大肠杆菌ATCC35218菌悬液经IPTG诱导后生长变化9. M15-pQE30-CT经IPTG诱导后细菌形态变化(三) IPTG诱导对含有不同区域片段pQE30-CT载体转化菌株生长的影响将CT段进行分解,共分成TM(跨膜段:810 aa～826 aa)、CD(胞内段: 827 aa～1032 aa)、CT1(CT前1/2段:810 aa～923 aa)、CT2(CT中1/2段:861 aa～972 aa)以及CT3 (CT后1/2段:931 aa～1032 aa),分别构建载体观察转化菌生长曲线。结果:一、TLR9胞外段与CpG DNA识别、结合LRR序列的确定(一)TLR9胞外段LRR2、5、8、11序列在大肠杆菌中的表达pET28-LRR8转化菌经IPTG诱导后有明显目的蛋白表达,而其它载体如pET28-LRR2、pET28-LRR5以及pET28-LRR11转化菌诱导后未见相应的蛋白条带。pET28-LRR2、pET28-LRR11转化菌在IPTG诱导6 h后,与未诱导组相比细菌数量显著减少,而转化pET28-LRR8的细菌未见此现象。(二)利用细菌生长变化推测TLR9胞外段与CpG DNA结合位点pET28a-LRR5转化菌在IPTG诱导后生长曲线无明显变化,而转化有pET28a-LRR11、pET28a-LRR2、pET28a-LRR8的BL21菌株经IPTG诱导后生长明显受到抑制。特别是pET28a-LRR11、pET28a-LRR2转化菌,IPTG诱导后生长完全受到抑制。pQE30表达载体也出现类似结果。(三)应用生物传感器技术检测LRR多肽与CpG DNA亲和力在LRR2、LRR5、LRR8、LRR11这4个多肽中,LRR11与CpG DNA 2006的亲和力最高,LRR8与CpG DNA 2006之间几无亲合力,LRR2和LRR5与CpG DNA 2006的亲合力约为LRR11与CpG DNA 2006亲合力的1/4～1/5,其中,LRR11多肽与CpG DNA的解离常数Kd值为13.2μM。(四)应用细胞因子释放抑制实验观察LRRs在结合CpG DNA中的作用4个多肽片段提前与CpG DNA孵育后,LRR8几乎没有抑制CpG DNA刺激小鼠腹腔巨噬细胞释放TNF-α的能力,而LRR11抑制巨噬细胞释放TNF-α的能力最强。(五)应用细胞内化实验观察LRRs对CpG DNA在细胞中聚集的影响LRR5、LRR8和LRR11能增加6-FAM CpG DNA在小鼠腹腔巨噬细胞内的荧光强度,各组细胞内平均荧光强度增加分别为27.3%、32.0%和69.2%。LRR11多肽能显著6-FAM CpG DNA在细胞内聚集,且呈明显的量效关系。对LRR11多肽的分析表明:LRR11多肽不含酸性氨基酸,有4个碱性氨基酸,等电点pI 11.10,增强CpG DNA在细胞内聚集可能与其呈强碱性有关。二、TLR9胞内段抑菌作用的发现和实验研究(一) TLR9胞内段CT序列在大肠杆菌中的表达构建了含有TLR9跨膜段、胞内段的pQE30-CT载体,转化大肠杆菌M15菌株,经Western-blot检测,发现该载体菌经IPTG诱导后能微量表达目的蛋白。另外,还发现重组菌在IPTG诱导4 h后,与未诱导组相比细菌数量显著减少,推测表达的蛋白具有一定的抑菌活性。(二) IPTG诱导对pQE30-CT转化细菌的生长的影响1. M15-pQE30-CT带有TLR9的跨膜段和胞内段TIR全序列,经1 mM IPTG诱导后,在各个时间段细菌生长均受到非常显著的抑制。2. M15-pQE30-CT,经0.1 mM、0.3 mM、1.0 mM、3.0 mM IPTG诱导后,在各个时间段细菌生长均受到非常显著的抑制,不同浓度IPTG组细菌生长曲线几乎完全重合,说明M15-pQE30-CT经IPTG诱导后生长受到抑制与IPTG的非特异作用无关。3.将pQE30-CT转化DH5α菌株,1 mM IPTG诱导,诱导后pQE30-CT DH5α转化菌在各个时间段均受到明显抑制,但是抑制作用不如M15转化菌株,可能与DH5α并非pQE30系列载体最适表达宿主菌有关。4.将M15-pQE30-CT菌株扩增至OD值2.0时用1.0 mM IPTG诱导2 h,发现IPTG诱导组细菌OD值明显下降,结果证实起始诱导细菌浓度不影响M15-pQE30-CT经IPTG诱导后生长抑制状态。5.在含有双抗(氨苄青霉素和卡那霉素)和不含双抗的LB培养液条件下,细菌诱导后生长均受到非常显著抑制,排除抗生素对其的影响。6.未诱导组细菌在第10 h达到生长平台期,IPTG诱导组细菌在前10 h内处于抑制状态,但从第10 h开始恢复生长,直至第20 h达到平台期。7. M15-pQE30-CT经IPTG诱导后超声上清不影响大肠杆菌ATCC35218生长,说明:①M15-pQE30-CT细菌诱导后细胞内没有“抑菌蛋白”;或者②M15-pQE30-CT细菌诱导后产生“抑菌蛋白”的量不够多,收集后还不足以抑制ATCC35218生长。8. M15-pQE30-CT和大肠杆菌ATCC35218不同比例菌悬液经过IPTG诱导后,除了单独M15-pQE30-CT组细菌生长受到抑制外,其余各组细菌生长无显著差异。说明M15-pQE30-CT细菌诱导后不能释放能抑制其它细菌生长的蛋白。9.未诱导组M15-pQE30-CT细菌革兰染色后,细胞形态清晰、完整,无聚团现象,经1.0 mM IPTG诱导2 h后,镜下细胞数量显著减少,细胞形态不完整、模糊。(三) IPTG诱导对含有不同区域片段pQE30-CT载体转化菌株生长的影响共构建了含有TM、CD、CT1、CT2、CT3片段的原核表达载体,观察细菌生长曲线变化,发现转化含有CT1段载体的细菌经IPTG诱导后细菌生长完全受到抑制,转化含有CD段载体的细菌经IPTG诱导后细菌生长部分受到抑制,而IPTG诱导对转化含有TM、CT2、CT3段载体细菌的生长没有影响。结论:1. TLR9胞外段LRR2、LRR5、LRR8、LRR11序列中,最有可能是CpG DNA结合位点的是LRR11序列,但不排除LRR2联合参与的可能性。1)原核表达LRR2、5、8、11蛋白,只有LRR8蛋白顺利表达,其它LRR未能正常表达;2)合成LRR2、5、8、11多肽,LRR11多肽与CpG DNA亲合力最高;3) LRR11多肽能抑制CpG DNA刺激小鼠腹腔巨噬细胞释放TNF-α以及增强荧光标记CpG DNA在小鼠腹腔巨噬细胞内聚集。2.构建含有TLR9胞内段的表达载体,表达的蛋白具有抑菌功能。