乳腺炎是一种常见的奶牛乳腺病原性感染病,不仅对动物福利、健康和生产性能造成严重影响,最终也会导致奶业全产业链的重大经济损失。金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,S.aureus）或脂磷壁酸（Lipoteichoic acid,LTA）刺激牛乳腺上皮细胞（bMECs,bovine mammary epithelial cells）后可引发炎症反应,从而影响奶牛乳腺的泌乳功能。目前,乳腺炎多采用抗生素治疗,但乳品生产中多重耐药菌产生的问题日益严重。因此,研究和开发一种安全有效的药物替代用于治疗奶牛乳腺炎的抗生素有很大必要。二甲双胍（1,1-二甲双胍盐酸盐）是在山羊豆中植物中发现的一种天然化合物,已被用于2型糖尿病（Type 2 diabetes,T2D）的临床治疗。由于其抗炎、抗氧化和抗癌等生物学功能,在过去的十年中引起了人们的关注。在pbMECs或S.aureus感染的小鼠乳腺组织中,二甲双胍对LTA诱导的乳腺炎模型的抗炎和抗氧化作用之间存在明显的联系。然而,二甲双胍调控乳腺炎的分子机制尚不清楚。本研究首先是利用RNA-Seq分析检测LTA刺激后pbMECs和二甲双胍治疗的基因转录调控差异。其次,利用分离的pbMECs揭示二甲双胍对LTA诱导的乳腺炎模型的影响,探索二甲双胍通过AMPK/NRF2/NF-κB信号通路在pbMECs中抑制LTA诱导的氧化应激和炎症反应。第三,证明二甲双胍可以通过调节MAPK和NF-κB信号通路来抑制促炎介质和pbMECs中PPARγ的激活。最后,评估二甲双胍在小鼠模型中是否对S.aureus感染的乳腺炎具有抑制作用,以及抗炎和抗氧化活性是否参与其作用机制。本研究进行了以下实验和分析,并得出相关结果。为了研究二甲双胍在pbMECs中LTA诱导的不同免疫和炎症反应的RNA-seq分析,设计了三个实验组:对照组,LTA组（细胞用100μg/mL LTA处理6h）和MET+LTA组(细胞用3 mM二甲双胍预处理12 h,然后用100 μg/mL LTA处理6 h。对照组细胞在正常培养液中培养12 h后,使用TRIzol?试剂收集细胞总RNA。RNA-seq转录组文库根据TruSeqTM RNA样品制备试剂盒（Illumina,San Diego,CA）使用1 μg总RNA制备。为了确定两个不同样本之间的差异表达基因（differential expression genes,DEGs）,按照转录本每百万 reads（transcripts per million reads,TPM）法计算各转录本的表达水平。通过基因本体论（Gene Ontology,GO）和京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）进行基因功能富集分析,筛选与全转录组相比在GO分析和KEGG代谢途径中显著富集的DEG,p值≤0.05。转录组分析显示,154个DEGs中LTA组vs对照组中共有121个DEGs,330个DEGs中LTA组vs MET组中共有297个DEGs。LTA处理后,两个处理组共有33个DEGs,其中25个基因表达上调,5个基因表达下调,而二甲双胍抑制了这些基因对LTA诱导产生的反应。这些DEGs主要通过NF-κB信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、IL-17信号通路、TNF信号通路、NOD-样受体信号通路和趋化因子信号通路来调控体外免疫和炎症反应。此外,GRO1、CXCL3、CXCL6、CXCL8、C3、C40、CSF1、TNFAIP2、IKBKE和IL6等基因与炎症密切相关。总的来说,不同的DEGs在功能上表达不同,LTA可能与pbMECs炎症反应的诱导相关,而添加二甲双胍可能抑制pbMECs炎症反应的过程。然而,二甲双胍抑制LTA诱导pbMECs炎症反应的分子调控机制有待进一步研究。为了验证pbMECs中二甲双胍抑制LTA诱导的氧化应激和炎症反应是否通过AMPK/NRF2/NF-κB信号通路,设计4个试验组,MET组用3 mM二甲双胍处理pbMECs12 h,LTA组用 100 μg/mL LTA处理 6 h。MET+LTA组以 3 mM 二甲双胍预处理细胞12 h,随后用100 μg/mL LTA处理细胞6 h。对照组添加等量PBS。采用流式细胞术（Annexin V-FITC法）分析二甲双胍预处理的pbMECs细胞凋亡情况。采用定量逆转录-聚合酶链反应（qRT-PCR）检测mRNA的表达情况,同时通过Western blot和免疫荧光检测二甲双胍和LTA对炎症和免疫反应中靶蛋白的表达情况。结果发现,与对照组相比,LTA诱导的细胞中COX2基因表达显著上调。二甲双胍可抑制LTA诱导的炎症基因NF-κBp65、TNFα、COX2、IL-1β的表达及NF-κBp65蛋白的核定位和磷酸化,但Nrf2和Nrf2靶向的抗氧化基因HO-1和Gpx1的转录增加,HO-1蛋白的核定位也增加。二甲双胍诱导的Nrf2激活与AMPK相关;二甲双胍预处理的pbMECs通过上调磷酸化的AMPK水平激活AMPK信号通路,同时也促进了被LTA抑制的Nrf2易位。研究结果表明,二甲双胍通过调控AMPK/Nrf2/NF-κB信号通路发挥抗炎和抗氧化应激的作用,揭示了 AMPK信号通路在奶牛乳腺炎治疗中的潜在作用。相关研究报道,二甲双胍可以通过AMPK依赖和非依赖的方式发挥抗炎作用。我们强调PPARγ在二甲双胍调节炎症中的调节。因此,二甲双胍通过PPARγ/MAPK/NF-κB信号通路抑制了 pbMECs中LTA诱导的炎症反应。我们使用了与第3部分相同的处理组pbMECs,采用EdU法检测pbMECs的增殖情况,采用qRT-PCR检测mRNA表达情况,同时采用免疫印迹和免疫荧光分析验证二甲双胍和LTA对炎症反应和抗炎反应中靶蛋白的表达情况。最后,用PPAR拮抗剂GW9662处理pbMECs,检测细胞内炎症标志物。结果表明,与对照组相比,LTA浓度为100μg/mL时可显著促进MAPK14、IL-6和IL-1βmRNA的表达情况（P＜0.05）。浓度为3 mM的二甲双胍对LTA介导的细胞增殖有抑制作用。EdU实验中,二甲双胍预处理后,能够增强了 LTA抑制的细胞染色强度。二甲双胍抑制LTA刺激的pbMECs中MAPK（ERK1/2、p38和JNK）的磷酸化表达,且能够降低LTA预处理后pbMECs中NF-κB、IL-8、IL-1β和IL-6蛋白的表达情况。同时,二甲双胍通过上调LTA刺激的pbMECs中PPARγ的表达以激活PPARγ磷酸化。GW9662处理后能够IL-6表达增加,而二甲双胍能够抑制IL-6表达。以上结果表明,二甲双胍可以通过部分依赖PPARγ激活的分子机制,抑制MAPK和NF-κB的激活,从而降低LTA刺激后pbMECs的炎症反应。结果表明二甲双胍具有抗炎作用,可用于奶牛乳腺炎的治疗。最后,为了验证二甲双胍是否能够抑制S.aureus感染小鼠乳腺的氧化应激和炎症反应。24只ICR小鼠随机分为4组。SA+Met组的6只小鼠先注射二甲双胍,24 h后用S.aureus攻毒;空白对照组的6只小鼠不进行任何处理;感染组的6只小鼠注射S.aureus;6只小鼠接种磷酸盐缓冲盐水（PBS）作为PBS组。此外,SA+Met组和感染组小鼠乳腺内注射50 μL S.aureus悬液（1 × 108 CFU/mL）。处理后将所有小鼠颈椎脱臼安乐死,无菌环境下取出乳腺组织进行qRT-PCR和Western blot。乳腺组织样本还用于制作石蜡切片进行病理检查。此外,在小鼠体内进行了白细胞总数分析。S.aureus诱导的小鼠乳腺炎模型小鼠乳腺组织学检查结果表明,肺泡出血和炎性细胞浸润有明显变化,二甲双胍处理后炎性症状明显减轻。在小鼠乳腺炎模型中,S.aureus处理后能够促进IL-1β、TNF-α和IL-6基因和蛋白表达显著上调（P＜0.05）。而二甲双胍处理后小鼠乳腺组织中上述关键炎症因子显著下调（P＜0.05）。与对照组相比,S.aureus刺激后小鼠乳腺炎症组织AMPKα磷酸化水平显著下调（P＜0.05）,而二甲双胍预处理后抑制了乳腺炎症组织AMPKα磷酸化水平。二甲双胍预处理后Nrf2转录表达水平上调,而S.aureus诱导Nrf2转录表达水平下调。结果表明二甲双胍可通过预防S.aureus诱导的小鼠乳腺炎症而发挥抗炎抗氧化作用。这些发现有助于开发和使用二甲双胍治疗小鼠乳腺炎的治疗方法。以上四章的结论是:首先,转录组分析显示丰富的DEGs在功能上表达不同,LTA可能与pbMECs炎症反应的诱导相关,而补充二甲双胍可能抑制炎症反应。此外,对于二甲双胍抑制LTA诱导的pbMECs炎症的分子调控机制有待进一步研究。其次,二甲双胍通过调控AMPK/Nrf2/NF-κB信号通路发挥抗炎症和氧化应激作用,表明AMPK信号途径在奶牛乳腺炎治疗中具有潜在的治疗作用。第三,二甲双胍可以通过抑制MAPK和NF-κB信号途径的激活来降低LTA刺激后pbMECs的炎症反应,其机制也部分与PPARγ的激活相关。最后,二甲双胍通过预防S.aureus诱导的小鼠乳腺乳房炎模型发挥抗炎抗氧化作用。总的来说,这些发现为二甲双胍作为治疗奶牛乳腺炎的新型治疗方法的研发提供了依据。