论文部分内容阅读
卵巢癌是严重危害女性身体健康的恶性肿瘤之一,目前卵巢癌死亡率高居妇科恶性肿瘤的首位[1-4]。虽然卵巢癌的手术方式和术后治疗手段在不断改进和提高[3,5-9],但是卵巢癌的五年生存率只有44%[6,8,10],造成这一现象的主要原因是因为卵巢癌缺乏早期特异性的诊断指标,这就造成了很多患者在发现病变时已处于晚期或癌细胞已经发生转移,使得卵巢癌治疗效果和预后均较差[8,11-17]。目前,卵巢癌常见的治疗手段是手术治疗和放化疗,但由于卵巢癌细胞存在耐药性,使得部分病人临床治疗的效果较差[18-20]。为了提高卵巢癌患者的生存周期以及预后生活质量,我们需要寻找新的治疗靶点,提高卵巢癌患者的生存率。目的本实验重点探讨O-GLcNAc糖基化介导的β-catenin水平变化对卵巢癌细胞增殖的影响,通过调节卵巢癌细胞O-GLcNAc糖基化水平变化,检测其对细胞增殖的影响,同时探讨O-GLcNAc糖基化变化引起的β-catenin变化,及其与细胞增殖之间的关系。方法与结果1.比较不同卵巢癌细胞株O-GLcNAc表达情况分别选取SKOV3细胞、A2780细胞、CAOV3细胞和OVCAR3细胞四种卵巢癌细胞株,通过Western blot比较各细胞株内O-GLcNAc表达情况。Western blot检测结果显示,SKOV3细胞中O-GLcNAc表达最高,而A2780细胞中O-GLcNAc表达最低。2.分别构建低表达和高表达O-GLcNAc的卵巢癌细胞株。利用慢病毒感染技术构建O-GLcNAc低表达的SKOV3细胞模型。利用O-GLcNAc水解酶(OGA)的抑制剂PUGNAc构建O-GLcNAc高表达的A2780细胞模型。Western blot检测结果显示,si OGT组(OGT慢病毒感染组)和si NC组(空白对照组)相比,OGT表达降低,O-GLcNAc水平降低,证明低表达O-GLcNAc的SKOV3细胞模型构建成功。PUGNAc组(50μmol/L的PUGNAc处理组)和空白对照组相比,O-GLcNAc水平增高,证明高表达O-GLcNAc的A2780细胞模型构建成功。3.检测O-GLcNAc表达变化对卵巢癌细胞增殖的影响。通过流式细胞技术检测O-GLcNAc糖基化对细胞周期的影响。低表达O-GLcNA的SKOV3细胞G1期细胞与对照组相比明显增多,S期和G2/M期细胞明显减少。而高表达O-GLcNAc的A2780细胞G1期细胞相对对照组明显减少,S期和G2/M期细胞明显增多。通过CCK8法检测O-GLcNAc糖基化对细胞增殖的影响,发现低表达O-GLcNAc的SKOV3细胞增殖能力与对照组相比明显降低,而高表达O-GLcNAc的A2780细胞增殖能力与对照组相比明显增强。4.O-GLcNAc通过修饰β-catenin影响卵巢癌细胞的增殖。通过Western blot检测发现,下调细胞内O-GLcNAc水平后β-catenin表达降低,而上调细胞内O-GLcNAc水平后β-catenin表达升高。通过RT-PCR检测发现,无论上调或下调O-GLcNAc水平,β-catenin蛋白的mRNA表达水平均无变化。Co-IP检测发现低表达O-GLcNAc的SKOV3细胞内β-catenin的O-GLcNAc化修饰水平相对对照组明显降低,高表达O-GLcNAc的A2780细胞内的O-GLcNAc化修饰水平相对对照组细胞明显增强。5.O-GLcNAc调控增高的β-catenin能进一步激活下游靶基因。通过提取细胞核蛋白,检测两组细胞模型细胞核内β-catenin含量,结果发现与之前结果一致,低表达O-GLcNAc的SKOV3细胞核内β-catenin表达水平相对对照组明显降低,高表达O-GLcNAc的A2780细胞核内β-catenin表达水平对对照组细胞明显增强。我们通过RT-PCR进一步检测了蛋白的下游靶基因CyclinD1和Axin2,结果发现β-catenin水平升增高后CyclinD1和Axin2的mRNA表达水平均增高,相反β-catenin水平降低后CyclinD1和Axin2的mRNA表达量也相应降低。结论本课题研究发现卵巢癌细胞内O-GLcNAc糖基化水平变化能通过β-catenin对卵巢癌细胞的增殖产生影响。