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猪精液超低温冷冻及复苏过程中,由于精子质膜的不饱和脂肪酸含量较高及精浆抗氧化能力较低,因而造成猪精子对低温休克及抗氧化损伤较为敏感。尽管精子的活力、结构及功能均受到一定程度的影响,但其活力等检测指标已经达到正常繁殖要求的理论值。然而利用猪冻精繁殖的受孕率及产仔率却大大降低,其原因至今尚未明确。尤其是猪冻融精子线粒体活性及质量特性与蛋白酪氨酸磷酸化之间相关性等研究报道较少。本研究采取6只优质长白猪精液,以BTS为稀释液、OEP及α-生育酚(VE)等成分作为防冻液及抗氧化成份,制成细管冻精,利用Annexin-V/PI、JC-1荧光抗体试剂盒与流式细胞术相结合的方法,检测猪精液冷冻前后精子质膜中磷脂酰丝氨酸(PS)位置、线粒体膜电位(ΔΨm)及活率状况的变化,同时采用蛋白免疫印迹技术(Western Blotting)检测猪冻融精子酪氨酸磷酸化蛋白种类及数量变化。从质膜结构完整性、线粒体活性及免疫组化角度,对添加不同防冻剂的猪冻融精子功能及酪氨酸磷酸化蛋白状况进行系统分析,准确、客观评价冻融精子的受精潜能,为猪精子低温生物学研究及利用冻精繁殖生产提供理论依据。结果表明：1、猪精子降温平衡及冷冻复苏后精子线粒体膜电位变化显著,其中低ΔΨm精子比例显著增加(p<0.05),同新鲜精子(17.10%)相比,降温平衡(37.89%)及冷冻复苏后(94.44%)低ΔΨm精子比例分别增加20.80和77.34个百分点(p<0.05),结果证实降温平衡及冻融过程容易导致猪精子线粒体膜电位去极化,显著降低猪冻融精子线粒体活性；2、超低温冷冻保存后活性精子的比例(50.89%)显著低于鲜精组(86.87%)(p<0.05),其中PS移位的精子“似凋亡”比例约为15.93%,同鲜精组(5.62%)相比增加10.30个百分点(p<0.05)。说明猪精子冷冻保存后线粒体膜电位及质膜完整率显著降低,同时能够诱导成活冻融精子提前进入“似凋亡”状态；3、添加OEP防冻剂、VE抗氧化成份有力提高冻融精子的质膜完整率、成活率及线粒体活性(高膜电位),尤其是OEP及VE联合使用更有利于提高猪冻融精子的质量。4、猪新鲜精子体外获能培养后,大约有16种蛋白发生酪氨酸磷酸化,发生酪氨酸磷酸化蛋白分子量约为：126kDa、108kDa、79kDa、69kDa、58kDa、50-42kDa、37kDa、34kDa、32kDa、26kDa、23kDa、20kDa、15kDa、14kDa、13kDa。其中分子量在50kDa-42kDa之间的蛋白表达量较高,且不随获能、培养温度条件的变化而改变,属于猪精子内生性恒定的酪氨酸磷酸化蛋白。其中分子量约为23kDa、14kDa和13kDa的酪氨酸磷酸化蛋白尚未见报道；5、猪精子超低温冷冻保存后,冻融精子蛋白酪氨酸磷酸化程度明显低于新鲜精子,其中冻融精子大分子量蛋白126kDa、108kDa、79kDa、69kDa、58kDa及32kDa蛋白酪氨酸磷酸化降低程度较为明显；6、添加OEP和VE后小分子量酪氨酸磷酸化蛋白的量要明显高于获能空白组,其中分子量大约为13kDa和37kDa蛋白的酪氨酸磷酸化最为显著。同OEP处理组相比,VE处理组对于79kDa、32kDa蛋白酪氨酸磷酸化提高的幅度有所加大。而OEP及VE联合使用试验组中冻融精子79kDa、58kDa、34kDa、32kDa、15kDa、13kDa蛋白酪氨酸磷酸化程度显著高于对照组；分子量约为32kDa酪氨酸磷酸化蛋白表达量与猪冻融精子质膜完整率、活力等质量相关性较高。本研究结果提示超低温冷冻保存不但能导致猪冻融精子质膜损伤,而且具有活性冻融精子中低线粒体膜电位及“似凋亡”精子比例的增加,同时冻融精子正常蛋白酪氨酸磷酸化程度明显减弱,这可能是猪冻精繁殖率降低的又一因素。OEP及VE可联合使用于猪精子冷冻防护剂之中。