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目的和背景： 各种原因引起的慢性疼痛是临床工作中的棘手问题之一，它不仅影响患者的生活质量，也逐渐成为了一项社会负担，但关于这方面的治疗进展甚为缓慢，目前已有的药物疗效尚不尽人意，这迫切需要我们医学工作者寻求更安全有效的治疗方法。 经多年的研究证实，生物镇痛具有广阔的发展前景，但目前目的基因、移植细胞和载体的研究尚在进行中。前期研究已证实内分泌肽家族之一的脑啡肽具有镇痛、免疫调节等作用，但要达到理想的镇痛效果需要较大的剂量。后续有研究表明κ受体激动剂强啡肽（dynorphin，Dyn）作为一种内源性镇痛介质，广泛分布于外周和中枢神经系统，其生物镇痛活性比脑啡肽强700倍，Long等[1]发现大鼠蛛网膜下腔注射Dyn的镇痛剂量仅为2.5～5.0 nmol就可以达到满意的镇痛效果，更适用于生物镇痛研究。骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）因为具有低免疫原性、多向分化潜能及定向归巢等生物学特性，成为理想的移植细胞。本实验研究拟以重组腺病毒载体为基础，将前强啡肽基因（prodynorphoin,PDP）导入到人骨髓间充质干细胞（hBMSCs），获得能表达强啡肽基因及分泌强啡肽蛋白的干细胞株（hBMSCs-PDP），并移植入坐骨神经慢性压迫性损伤（chronic constriction injury，CCI）模型的大鼠髓鞘内，利用BMSCs的定向归巢和定向分化的特性，实现靶向性转基因细胞镇痛，评价其镇痛效应，为生物镇痛技术的发展和临床应用奠定基础。 1.材料和方法： 1.1重组腺病毒Ad5F35-PDP 前期实验肖建斌等[2]人已成功构建用Ad5F35载体制备携带前强啡肽原基因的重组腺病毒Ad5F35-PDP并馈赠于本实验研究。该实验运用第5代腺病毒Ad5F35，通过与AdMaxTM系统进行同源重组，制备了含前强啡肽（prodynorphin，PDP）基因全序列的Ad5F35-PDP重组腺病毒，并对其进行了滴度测定，为本实验对该重组腺病毒的生物学功能研究及今后的转基因治疗奠定了良好的基础。 1.2重组腺病毒Ad5F35-PDP转染人骨髓间充质干细胞hBMSCs 本实验以重组腺病毒Ad5F35-PDP为载体，将前强啡肽基因（PDP)导入人骨髓间充质干细胞（hBMSCs），获得具有分泌强啡肽特性的细胞株，同时探讨转基因建立的细胞株hBMSCs-PDP的的增殖情况、细胞活力、传代过程中细胞形态学是否发生改变，以及目的基因强啡肽的表达情况。最后通过体内实验，将转基因细胞株hBMSCs-PDP移植入神经病理性疼痛大鼠髓鞘内，利用hBMSCs在体内定向归巢和定向分化的特点，验证hBMSCs-PDP靶向性转基因细胞的镇痛效果。 1.3神经病理性疼痛模型大鼠髓鞘内注射hBMSCs-PDP的镇痛效果 取健康雄性SD大鼠40只（实验过程中各种原因淘汰的大鼠均由后续实验补齐），体重150～180 g，周龄6～8周，随机分为4组（n=10），A组为正常对照组；B组、C组和D组均行髓鞘内置管，导管固定于大鼠背部皮下，且均在大鼠右腿（术侧）通过坐骨神经慢性压迫性损伤法（CCI）建立神经病理性疼痛模型，于CCI术后3 d分组给药。B组髓鞘内注射无菌生理盐水20μl；C组鞘内注射转染空载体48h的hMSCs细胞悬液(hMSCs-空载体)20μl（1×106-2×106/μl）；D组鞘内注射转染目的基因前强啡肽原48h的hMSCs细胞悬液（hMSCs-PDP）20μl（1×106-2×106/μl）。于手术前1d、手术后第3、5、7、9、11、13d分别测定SD大鼠右腿（术侧）热痛阈值。分别于术后第7d和第13d测完SD大鼠术侧热痛阈值后，取SD大鼠的新鲜脊髓组织，行免疫组化检测脊髓后角强啡肽的表达情况，采用RT-PCR法测定PDP mRNA的表达，western blot法测定PDP蛋白的分泌，最后用裸鼠致瘤实验检验hMSCs-PDP细胞系的安全性。 2统计分析 采用SPSS13.0统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差（ SDX±）表示。组间及组内均数的比较采用重复测量设计方差分析；两两比较采用LSD分析，以 P<0.05为差异有意义。 3结果： 1）重组腺病毒 Ad5F35-PDP成功转染人骨髓间充质干细胞（hBMSCs），并建立hBMSCs-PDP细胞株用于后续实验。 2） SD大鼠坐骨神经慢性压迫性损伤法（CCI）神经病理性疼痛模型提示：与A组比较， B组、C组、D组热痛阈值降低(P<0.05)。与B组、C组比较，D组热痛阈值升高（P<0.05）。RT-PCR结果提示D组脊髓组织强啡肽mRNA表达比A组、B组、C组升高。免疫组化结果显示：D组强啡肽表达较B组和C组增强。最后将转基因细胞株注入裸鼠体内，观察一个月后未发现致畸致瘤性，表明注入的hBMSCs-PDP细胞系是安全的。 4结论： 1）重组腺病毒Ad5F35-PDP可成功转染人骨髓间充质干细胞。 2）大鼠髓鞘内注射hBMSCs-PDP可减轻CCI模型SD大鼠的神经病理性疼痛，证实hBMSCs可携带镇痛基因PDP定向归巢至中枢神经系统，发挥镇痛效应。 3）hBMSCs-PDP作用于裸鼠未发现致畸致瘤性，因此该细胞系用于细胞镇痛研究是安全的，有望今后应用于细胞移植镇痛的临床治疗。