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异育银鲫因具有良好的经济性状,在淡水渔业中占据着十分重要的地位。然而近年来,因感染鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)导致的鳃出血病,严重威胁着异育银鲫的养殖产业。并且常在15-25℃时发病,高于25℃或低于15℃时常可带毒生存。开展异育银鲫鳃出血病发病机制的研究,并找出可有效抑制病毒增殖的药物或方法,可有效缓解鳃出血病带来的危害。本文通过对健康的异育银鲫及感染CyHV-2的异育银鲫进行转录组测序,运用生物信息学方法对所获得的Unigene进行了功能注释,代谢途径等分析,并进行了两者的对比研究。在鉴定了一系列与免疫相关的基因的基础上,利用PCR和RACE技术对异育银鲫的Prx基因进行了 cDNA全长的克隆,并研究了人工感染CyHV-2后Prx基因在异育银鲫体内的表达;同时通过分别给异育银鲫体内注射HSP70促进剂和抑制剂的人工干预,结合CyHV-2人工感染,检测其生理生化层面的机体响应,并检测不同人工干预状态下病毒的增殖拷贝数;最后通过生产上给异育银鲫注射疫苗的人工干预,检测了异育银鲫注射疫苗组和对照组血清生化指标、血清和组织中免疫指标以及免疫球蛋白轻链基因和重链基因的表达量。通过以上研究,以期追溯异育银鲫鳃出血病的病因,找出可以人工抑制病毒增殖的方法,并评估土法疫苗实施的有效性。结果表明,分别对健康的异育银鲫及感染CyHV-2的异育银鲫肠粘膜进行转录组测序,经生物信息学分析,共获得了 51 1 179个转录本,314941条Unigene,其中有139178条Unigene被成功注释。KEGG注释结果表明,疾病感染途径、癌症通路、信号转导通路和免疫系统途径涉及到的Unigene分别有2464个、1098个、788个和443个。患鳃出血病异育银鲫与健康异育银鲫相比,其肠粘膜转录组共有7770个基因显示出显著差异表达,其中4435个基因下调,3335个基因上调。其中分别有1431个、388个和2618个差异表达基因比对到生物过程(BP)、细胞组分(CC)和分子功能(MF)数据库中。经注释到KEGG数据库比对到的差异表达基因共8727条,显著富集到309条通路,主要为与癌症相关的小RNA通路、ITRP通路的炎症介质调节信号通路和氧化磷酸化等通路。经对基因注释功能的分析,发现与免疫功能相关的基因中,显著上调的有28个,显著下调的有20个。异育银鲫感染CyHV-2后,热休克蛋白70、过氧化物还原酶、白细胞介素6受体β亚基、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶和白细胞介素6等基因表达量增高,而胞外超氧化物歧化酶、铜锌超氧化物歧化酶和谷胱甘肽S-转移酶等表达量则下降。接着,采用RT-PCR和cDNA末端快速扩增(RACE)技术从异育银鲫肝脏中克隆了过氧化物还原酶(Prx)基因的cDNA全长序列。异育银鲫的过氧化还原酶(CaPrx)基因cDNA全长1 035 bp,开放阅读框594 bp,编码197个氨基酸。在氨基酸序列的N端和C端各有一个保守的Cys残基,属于2-半胱氨酸类Prxs家族。经多序列比对和系统进化树分析表明,异育银鲫的Prx基因与鲫、青鱼、斑马鱼、犀角金线鲅和鳑鲏等鱼类具有很高的同源性。实时荧光定量PCR结果显示,CaPrx在异育银鲫体内广泛表达,在血细胞和肝脏中表达量最高,在鳃和头肾的表达量较少。在感染CyHV-2的个体中,肝脏和脾脏的CaaPrx基因表达量显著下降,表明其抗氧化作用因病毒的感染而受到了一定的破坏。鉴于鳃出血病与温度相关的发病特征,分别对异育银鲫注射HSP70抑制剂和促进剂进行了其体内热休克蛋白的人工干预。研究发现,养殖池塘自然发病的具有鳃出血病典型症状的异育银鲫,其肝脏内HSP70基因的表达量与健康异育银鲫相比明显升高(P<0.01),人工感染CyHV-2病毒后,肝脏内HSP70表达量在24h后显著增加(P<0.05),当鱼体表现出发病症状时,HSP70表达量极显著上升。对照组在人工感染CyHV-2后,血清中天门冬氨酸氨基转移酶在鱼体发病时显著升高(P<0.05),且在发病时与注射促进剂和抑制剂组都有极显著差异;注射HSP70促进剂组在人工感染CyHV-2后,血清中天门冬氨酸氨基转移酶和丙氨酸氨基转移酶在12时显著升高,而碱性磷酸酶和白蛋白并没有明显变化。注射HSP70抑制剂的异育银鲫体内病毒数在感染病毒后12h时,就达到最高点,明显高于对照组及注射HSP70促进剂组的同时间段病毒数(P<0.01)。而对照组和注射HSP70促进剂组,在病毒的增殖趋势及数量上,两者都没有明显差异。最后,本文评估了在生产上给异育银鲫注射疫苗这种人工干预下异育银鲫的生理响应及体内免疫球蛋白重链、轻链基因的表达情况。通过对注射疫苗组异育银鲫和对照组的比较研究,从生长指标、血清生化指标、免疫指标等方面鉴定了注射疫苗带来的免疫效应。分别测定了注射疫苗组和对照组异育银鲫血清与肝脏组织匀浆中过氧化氢酶(CAT)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、总抗氧化能力(T-AOC)和溶菌酶(LZM)的含量,结果发现,注射疫苗组异育银鲫血清与肝脏中的T-SOD均高于对照组(P<0.05);疫苗组异育银鲫血清与肝脏中的T-AOC均高于对照组,且在血清中有显著差异(P<0.05)。注射疫苗组异育银鲫免疫球蛋白轻链基因Igλ除在肠粘膜中没有明显变化外,在肝脏、脾脏和头肾中均高于对照组,且在肝脏中有极显著差异(P<0.01)。注射疫苗组异育银鲫免疫球蛋白重链基因Ighm在肝脏和头肾中表达量都较对照组高,但没有显著差异。注射疫苗组异育银鲫血清中白蛋白含量显著高于对照组(P<0.05)。经对注射疫苗组与对照组异育银鲫肥满度、肝脏指数、头肾指数和脾脏指数的测定,发现疫苗组的肥满度与肝脏指数均显著高于对照组(P<0.01)。本文结果显示:异育银鲫感染CyHV-2可使肠粘膜基因显著性差异表达;当异育银鲫体内的热休克蛋白被人为抑制时,鱼体对CyHV-2病毒的抵御能力大大下降,HSP70在抵御病毒的增殖中具有一定的积极作用。