论文部分内容阅读
目的:长链非编码RNAs（lncRNAs）通常是指长度＞200nt且不具有蛋白编码功能的一类转录本。lncRNAs可在各个关键的生物学过程中发挥重要的作用,其作用模式复杂多样。目前已发现有若干与子宫内膜蜕膜化相关的lncRNA分子,如LINC00473、CD36-005、TUNAR、HOXA11-AS、HOTAIR、Hand2os1、HK2P1和PGK1P2等。研究显示,这些在妊娠早期子宫内膜蜕膜化过程中表达异常的lncRNA分子直接或间接参与了蜕膜化的发生发展。然而,lncRNAs在子宫内膜蜕膜化中的潜在分子调控机制仍不明确。因此,本研究旨在从表观遗传学的角度探究lncRNAs在小鼠子宫内膜蜕膜化中的作用及其调控机制,为后续lncRNAs在蜕膜化中的功能研究提供实验依据。方法:1.采用RNA测序技术对小鼠孕第6天（D6）胚胎着床点和着床旁子宫内膜组织中的lncRNAs和m RNAs的表达进行检测和分析。2.采用加权基因共表达网络分析方法对RNA测序数据进行深度分析,获得与小鼠子宫内膜蜕膜化显著相关的核心lncRNAs。3.分别构建正常妊娠小鼠模型、假孕小鼠体内人工诱导蜕膜化模型和原代小鼠子宫内膜基质细胞体外诱导蜕膜化模型,通过RT-q PCR对核心lncRNAs在以上3个模型中的表达进行分析,获得目标研究对象lncRNA RP24-315D19.10。4.利用RP24-315D19.10-siRNA构建小鼠子宫内膜基质细胞RP24-315D19.10干扰模型,采用F-actin染色、RT-q PCR、细胞免疫荧光、TUNEL染色和Western blot对RP24-315D19.10-si RNA干扰后的基质细胞在蜕膜化过程中的形态改变、蜕膜化标志分子的表达、细胞增殖及凋亡水平进行检测分析。5.对RP24-315D19.10互作蛋白进行筛选:（1）采用RNA FISH和细胞核/质RNA分离技术分析RP24-315D19.10的亚细胞定位;（2）采用RNA pull-down结合蛋白质谱分析技术预测筛选RP24-315D19.10的互作蛋白;（3）采用RNA免疫共沉淀验证RP24-315D19.10与候选蛋白hn RNPA2B1的互作;（4）采用Western blot检测hn RNPA2B1在RP24-315D19.10干扰模型中的表达。6.对hn RNPA2B1在蜕膜化中的作用进行研究:（1）利用hn RNPA2B1-si RNA构建小鼠子宫内膜基质细胞hn RNPA2B1干扰模型,采用F-actin染色、Western blot对hn RNPA2B1-si RNA干扰后的基质细胞在蜕膜化过程中的形态改变、蜕膜化标志分子的表达、细胞增殖及凋亡标志分子的表达进行检测分析;（2）利用RP24-315D19.10-si RNA干扰小鼠子宫内膜基质细胞内RP24-315D19.10表达的同时,使用质粒过表达hn RNPA2B1,之后采用F-actin染色、Western blot对hn RNPA2B1过表达后的基质细胞在蜕膜化过程中的形态改变、蜕膜化标志分子的表达、细胞增殖及凋亡标志分子的表达进行检测分析;（3）采用免疫组化、Western blot检测hn RNPA2B1在正常妊娠和自然流产患者子宫蜕膜组织中的表达水平。7.对RP24-315D19.10的功能性位点进行预测分析:（1）采用cat RAPID数据库预测RP24-315D19.10和hn RNPA2B1的结合位点;（2）采用UCSC数据库对RP24-315D19.10进行同源序列比对,得到与RP24-315D19.10具有同源序列的人lncRNA TRAM2-AS1;（3）采用RT-q PCR检测人lncRNA TRAM2-AS1在正常妊娠和自然流产患者子宫蜕膜组织中的表达水平。结果:1.RNA测序分析结果显示,在D6小鼠胚胎着床点子宫内膜组织中共有21个差异表达的lncRNAs,其中7个上调、14个下调,以及586个差异表达的m RNAs,其中312个上调、274个下调（|log2FC|?1,P＜0.05）。进一步的GO和KEGG分析结果提示这些差异表达的lncRNAs和m RNAs可能参与小鼠子宫内膜蜕膜化。2.通过WGCNA分析,从复杂的RNA测序数据中筛选出4个核心lncRNAs,即2010204K13Rik、Gm26737、Gm4258以及RP24-315D19.10。3.RT-qPCR结果显示候选目标lncRNA RP24-315D19.10在小鼠子宫内膜蜕膜化中表达上调。4.蜕膜化相关指标分析结果显示,在体外诱导蜕膜化过程中,干扰RP24-315D19.10导致基质细胞骨架重塑失败,蜕膜化标志分子Dtprp、Cox-2、BMP2和增殖标志分子Ki-67、PCNA的表达,以及凋亡标志分子Bcl2/Bax的比值均显著下调,提示干扰RP24-315D19.10可显著抑制小鼠子宫内膜基质细胞蜕膜化。5.RNA FISH和细胞核/质RNA分离实验结果表明RP24-315D19.10定位于细胞质中。进一步的RP24-315D19.10互作蛋白的相关分析结果显示,RP24-315D19.10与hn RNPA2B1直接结合并上调hn RNPA2B1的表达。6.蜕膜化相关指标分析结果显示,在体外诱导蜕膜化过程中,干扰hn RNPA2B1导致基质细胞骨架重塑失败,蜕膜化标志分子Cox-2、BMP2和增殖标志分子PCNA的表达以及凋亡标志分子Bcl2/Bax的比值均显著下调,而过表达hn RNPA2B1可以逆转干扰RP24-315D19.10所致的蜕膜化损伤表现。相比于正常妊娠者,hn RNPA2B1在自然流产患者子宫蜕膜组织中的表达显著降低。以上结果提示,hn RNPA2B1参与调控子宫内膜蜕膜化。7.cat RAPID分析和同源序列比对结果显示,143-167核苷酸位点可能是RP24-315D19.10的功能性位点,与此位点序列具有同源序列的人lncRNA TRAM2-AS1在自然流产患者子宫蜕膜中的表达较正常妊娠者显著增高。结论:lncRNA RP24-315D19.10通过上调hn RNPA2B1促进小鼠子宫内膜基质细胞蜕膜化。