研究背景：近年来,越来越多的关于间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)的基础和临床实验在全世界多学科各专业中进行,这点燃了对多种难治性疾病的治疗新希望。MSCs是一群具有自我更新和多向分化潜能的基质干细胞,能够分化为中胚层、内胚层和外胚层来源的细胞,如骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞和神经细胞等[1-4]。另外,MSCs在体外可以扩增很多代而不失去其自我更新的能力[5-7]。不断有证据证明MSCs具有潜在的免疫调节功能、抗炎症的能力、营养和修复作用[8、9]。MSCs的修复作用主要依赖其分化作用和旁分泌作用。而在两种方式中,越来越多科学家倾向认为MSCs对器官的修复作用主要是通过其旁分泌作用,而不是分化作用[10-13]。MSCs需要归巢到损伤部位才能发挥其修复作用。在动物实验中发现,静脉注射到小鼠体内的MSCs通过进入血液循环,24h后以肺含量最高,其次为肾脏、肝、脾和骨髓。然而无论是通过荧光蛋白视踪、实时PCR、免疫组化,还是原位荧光杂交的方法,都发现只有少量的MSCs能归巢到靶器官或者靶组织,这将严重影响到MSCs的临床应用及疾病治疗的效果[14-17]。因此,探索MSCs安全高效归巢到靶器官组织的方法成为了现今医学的研究热点。最近有研究通过高分辨率共聚焦动态显微镜观察发现,当体内某一器官组织出现炎症或缺血状态时,受损的器官组织会释放一系列的炎症因子和趋化因子。MSCs受到炎症因子和趋化因子的吸引到达炎症或缺血的器官组织处周围的血管,优先黏附和穿过那些经炎症因子肿瘤坏死因子-α (TNF-α)刺激后的血管上皮[18]。TNF-α刺激血管上皮细胞和MSCs,使两者的血管细胞黏附因子-1(VCAM-1)及其受体迟缓抗原-4(very late antigen-4,VLA-4)表达增加,促进两者间的黏附和固定。MSCs会通过VCAM-1/VLA-4和G蛋白复合受体的方式黏附到血管上皮上,再通过上皮层分离的裂口和孔,从上皮细胞间渗入或者直接穿过上皮细胞的两种运动方式穿过血管内皮细胞到达到靶组织,实现其修复作用。有研究发现运用抗单克隆抗体阻断VCAM-1后,可明显减少MSCs与血管内皮的黏附,从而减少归巢到损伤部位的MSCs的数量[19]。可见TNF-α和VCAM-1在MSCs迁移过程和黏附中均占有重要的作用。MAPK (mitogen activated protein kinase)即丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路,在各种刺激因素(如生长因子、炎症因子等)的作用下,通过一系列激酶的磷酸化级联反应,影响细胞核内基因的转录和调控,参与调节细胞的增殖、分化、转化和凋亡等一系列基本细胞生命活动。根据MAPKs信号通路的激酶的亚类不同,主要分为ERK1/2、JNK、p38和ERK5四条信号转导通路。而核转录因子NF-κB广泛存在于真核细胞内,是一种具有多向性、多功能的调节蛋白,NF-κB信号通路参与机体免疫反应、炎症反应和肿瘤发生发展等多种生理病理过程。既往研究发现,TNF-α不通过ERK、JNK和p38MAPK信号通路,而是通过NF-κB信号通路刺激人血管上皮细胞生成VCAM-1.在小鼠MSCs中,血小板来源生长因子BB通过PI3K, p38MAPK和NF-κB信号通路转到生成VCAM-1.因此,我们推测TNF-α可促进MSCs VCAM-1的表达,过程中可能涉及ERK、JNK和NF-κB信号通路的活化。目的：探究TNF-α与MSCs的VCAM-1两者间的相关关系,以及MSCs迁移／归巢过程中所涉及的有关信号通路,旨在明确MSCs的迁移和归巢机制,以提高临床细胞治疗的疗效。方法：(1)在取得健康捐献者本人的同意并签订知情同意书后,从捐献者髂骨取出l0ml骨髓液。应用密度梯度离心法结合贴壁培养法分离出人骨髓MSCs。(2)采用流式细胞术对第3代MSCs表面抗原进行检测。(3)将第3代MSCs添加到成脂、成骨诱导液中进行诱导分化鉴定。(4)用终浓度为6.25、12.5、25、50、100ng/ml的TNF-α刺激MSCs24h,用流式细胞术检测MSCS膜上VCAM-1的表达,50ng/ml TNF-α刺激MSCs24h后,QPCR检测VCAM-1mRNA的表达,以及Western blotting检测NF-κB、ERK和JNK信号通路的活性。(5)采用流式细胞术、QPCR和Western blotting检测NF-κB信号通路抑制剂PDTC、ERK信号通路抑制剂U0126和JNK信号通路抑制剂SP600125单独及分别与TNF-α共刺激MSCs后对其VCAM-1、VCAM-1mRNA和各自信号通路活性的影响。统计学方法：应用SPSS16.0软件统计分析数据,计量资料均以(x±s)表示,两组间比较采用独立样本t检验分析,多组间比较采用单因素方差分析,当方差不齐时采用近似F检验Welch法；多重比较时方差齐采用Turkey法,方差不齐采用Dunnett’T3法。检验水准a=0.05,双侧检验。结果：(1)经密度梯度离心法结合贴壁培养法分离的人骨髓MSCs,培养至第3代,见细胞形态均一、呈成纤维细胞样、贴壁生长。(2)流式细胞术分析结果示细胞CD29(99.60%)、CD69(7.93%)、CD44(99.95%)、CD105(99.89%)呈阳性表达,而CD34(0.51%)、CD45(1.67%)阴性表达。符合MSCs表型的标准。(3)细胞经成脂诱导第4天后,部分细胞胞内开始出现小脂滴,然后脂滴逐渐增多,到14天时可以发现细胞内大而圆的脂滴,经过油红O染色后脂滴红染,证明细胞能分化为脂肪细胞。细胞经成骨诱导第21天后,用茜素红染色后可见大量红染的钙化结节,证明细胞能分化为骨细胞。(4)用不同浓度的TNF-α刺激培养MSCs24h后,用流式细胞术分析可见TNF-α能明显地增加MSCs膜上VCAM-1的表达,两者呈浓度依赖关系,随着TNF-α浓度的增加,VCAM-1的表达率明显增高,与对照组相比,差异具有统计学意义(p<0.05)。TNF-α浓度增加到50ng/ml时,VCAM-1表达率为97.72%, VCAM-1表达率达到峰值。TNF-a显著增加VCAM-1mRNA的转录水平,50ng/ml的TNF-α刺激培养MSCs24h后其VCAM-1mRNA为对照组的28.39倍,差异具有统计学意义(p<0.05)。Western blotting检测结果见TNF-α刺激培养24h后MSCs的NF-κB、ERK和JNK信号通路的磷酸化程度明显增加,与对照组的差异具有统计学意义(p<0.05)。(5)三种信号通路抑制剂PDTC、U0126、SP600125分别刺激培养MSCs24h后其VCAM-1表达率分别为6.40%、5.22%、6.21%,与对照组(8.49%)比较无统计学差异(p>0.05);QPCR检测其VCAM-1mRNA分别为对照组的1.08倍、1.60倍和1.04倍,与对照组比较亦无统计学差异(p>0.05)；其对应的NF-κB、ERK及JNK信号通路磷酸化程度与对照组比较均无统计学差异(p>0.05)。(6)PDTC、U0126和SP600125分别与TNF-α联合刺激培养MSCs24h后其VCAM-1表达率分别为19.56%、20.20%和19.59%,与单独TNF-α组比较,差异均具有统计学差异(p值<0.05)；QPCR检测其VCAM-1mRNA分别为对照组的11.30倍、14.92倍和20.66倍,与单独TNF-α组比较,均具有统计学差异(p<0.05)。其中PDTC+TNF-α共刺激培养组的NF-κB信号通路磷酸化比值为0.77,TNF-α组为1.03,两者差异具有统计学意义(p<0.05)；U0126与TNF-α共刺激培养组的ERK信号通路磷酸化比值为0.93,与单独TNF-α刺激培养后对应的信号通路磷酸化程度比较(1.40),差异有统计学意义(p<0.05)；而SP600125与TNF-α共刺激培养组的JNK信号通路磷酸化比值为2.01,虽较TNF-α单独刺激培养组减低(3.70),但两者间无差异统计学(p>0.05)。结论：1)TNF-α能显著增加人骨髓MSCs表面VCAM-1及VCAM-1mRNA的表达,且两者呈浓度依赖关系,在50ng/ml TNF-α刺激时,VCAM-1的表达达到峰值。2)TNF-α能明显提高NF-κB、ERK、JNK信号通路蛋白的磷酸化,从而增加3条信号通路的活性。3)NF-κB、ERK、JNK信号通路的抑制剂PDTC、U0126、SP600125能抑制TNF-α对VCAM-1和信号通路活性的促进作用。