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目的:慢性肾脏病(Chronic kidney disease,CKD)患者心血管疾病(Cardiovascular disease,CVD)发病率及死亡率较普通人群明显升高,其主要原因可能是CVD构成了慢性肾脏病患者死亡的主要危险因素,约占总其死亡率的50%以上,更有研究表明,心血管事件中,冠状动脉钙化约占20%。而与传统的冠脉钙化不同,CKD患者的血管钙化主要发生在中膜,主要由血管平滑肌构成,目前已有大量研究表明,随着CKD患者肾功能丧失,对磷清除减少,进而血清磷升高,促进了CKD血管钙化,血清磷是促进CKD患者血管钙化的独立危险因素。大量基础研究表明,高磷环境促进了血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cells,VSMCs)表型向成骨/成软骨样转化、促使核心结合因子α1(Cbfα1)、骨形成蛋白BMP-2表达上调而诱导钙化,高磷诱导VSMCs表型转化是血管钙化发生的中心环节,同时还涉及凋亡等其他多种因素,其具体机制目前仍未明确。而目前现实中对血管钙化的预防与治疗方面尚无行之有效的方法及措施。研究显示干扰素γ对成骨细胞和破骨细胞的生成有一定的调节作用,而VSMCs发生表型转化的过程恰恰与此过程相似。本研究旨在研究高磷诱导血管钙化的基础上增加干扰素γ,观察干扰素γ能否抑制或减轻血管钙化程度。方法:1采取大鼠主动脉组织块贴壁法原代培养并获取VSMCs,并应用形态学及细胞免疫学的方法对VSMCs进行鉴定。2实验分组及干预处理:将VSMCs应用随机分组方法分为阴性对照组、高磷组及干扰素γ干预组,阴性对照组采用低糖的DMEM加10%胎牛血清作为正常培养基进行培养,高磷组是在正常培养基的基础上加入浓度为10 mmol/Lβ-甘油磷酸配制成的高磷培养基培养,干扰素γ干预组在上述高磷培养基的基础上加入干扰素γ,使干扰素γ的最终浓度为100u/m L,各组共刺激VSMCs共3 d。3钙化检测:各组VSMCs培养14d后分别用茜素红(Alizarin red stain)钙化染色和比色法测定细胞的钙含量。4碱性磷酸酶(ALP)活性测定:取3~4代细胞接种于6孔板,细胞密度大约为2×105/孔,干预时间为7 d,弃去培养基,PBS液洗涤细胞2-3次,每孔加入500μL 0.1%Triton X~100置于4℃环境中约12~24 h,然后反复吹打裂解细胞,并置于离心管中离心,应用化学发光法检测ALP的活性。5采用RT-PCR方法研究高磷、干扰素γ干预组对VSMCs中Cbfα1、BMP-2、Smad1、Smad7 m RNA水平表达的影响。6蛋白印迹法检测:取干预3 d的各组细胞,按照常规方法提取蛋白质并用BCA试剂盒进行蛋白定量,十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离,转膜、封闭,加一抗(B-actin1:1000,Cbfα1 1:500)稀释液,4℃孵育过夜。洗膜3次后加入荧光二抗稀释液(1:2000),室温下孵育2 h,用免疫荧光成像系统显色,应用图像分析软件对条带进行扫描并测得灰度值,计算蛋白表达量,实验共重复3次。7统计学方法:采用SPSS13.0统计学软件对所有数据进行统计学处理,符合正态分布的计量资料用均数±标准差(sx?)表示,两组间均数比较用t检验,多组间均数比较采用单因素方差分析(ANOVA),不符合正态分布的计量资料用中位数表示,用秩和检验进行多组间比较,用S-N-K检验(student-Newman-Keuls,SNK)作多组间均数两两比较。P<0.05为差异有统计学意义。结果:1 VSMCs原代培养:采用组织块贴壁法获取原代SD大鼠VSMCs,正常情况下组织块开始贴壁约3-4 d后即可见少量细胞沿组织边缘爬出,形状呈长梭形,分散束状排列,细胞数量随着时间延长而逐渐增多,约培养6-7 d后细胞可长满瓶底面积的70%左右。细胞数量约占瓶底面积80-90%即可传代,传代后由于胰酶的消化作用,细胞起初并未贴壁,而是呈现圆形或椭圆形漂浮于瓶底,逐渐贴壁后右可恢复成长梭形,胞浆饱满丰富,胞核为卵圆形或椭圆形,可见细胞交互生长,镜下可见典型的“峰-谷”现象。用免疫细胞化学法对平滑肌细胞进行特异性抗体检测,即α-平滑肌肌动蛋白抗体(α-SMA actin)进行检测,胞浆α-SMA actin若出现强表达,或见到棕黄色免疫反应产物,则可判定为是平滑肌细胞。2茜素红钙化染色结果显示:高磷组、干扰素γ干预组与阴性对照组相比,2组中VSMCs钙化染色均有不同程度的加重,而干扰素γ干预组与高磷组比较,钙化染色程度呈现显著降低。3钙含量检测结果显示:与阴性对照组相比,高磷组及干扰素γ干预组刺激VSMCs后,钙含量均显著增加,干扰素γ干预组与高磷组相比,钙含量明显降低,其各组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。4 ALP活性测定结果:与阴性对照组相比,高磷组及干扰素γ干预组VSMCs的ALP水平均有不同程度地升高。干扰素γ干预组与高磷组比较,干扰素γ干预组ALP活性降低。5 RT-PCR检测各组VSMCs中Cbfα1、BMP-2、Smad1、Smad7 m RNA的表达结果显示:与阴性对照组相比,高磷组及干扰素γ干预组的VSMCs Cbfα1、BMP-2、Smad1m RNA水平均不同程度地增加,而Smad7 m RNA有所下降,干扰素γ干预组与高磷组比较,Cbfα1 BMP-2、Smad1m RNA水平也有所下降,Smad7 m RNA水平有所上升,各组间比较均有统计学意义。结论:1本课题采用SD大鼠胸主动脉组织块贴壁法成功地培养了原代VSMCs,为原代培养VSMCs及提供了重要的实验平台。2高磷培养基成功的诱导了VSMCs发生钙化,并且给予干扰素γ干预后在一定程度上抑制了高磷诱导的VSMCs钙化。3干扰素γ抑制高磷诱导的VSMCs发生钙化可能是通过抑制VSMCs表型转化这一机制来实现的。