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茄子(Solanum melongena L.)是茄科重要蔬菜之一,其风味别致、营养价值高,深受消费者欢迎。但是,在茄子的栽培过程中常常会受到衰老和各种逆境的影响,给生产造成很大损失。近几年随着生物技术的发展,已经可以采用转基因技术对茄子的性状进行改良。 异戊烯基转移酶(Isopentenyl-Transferase,IPT),也称细胞分裂素合成酶,是植物细胞分裂素合成的限速酶。IPT在转基因植株中表达后,会使植株细胞分裂素含量增加,衰老延缓,抗性提高,但过高对植物的生长和育性都是有害的。如果将衰老特异性启动子PSAG12与IPT融合,在PSAG12的启动下,IPT只有在叶片衰老时才表达合成细胞分裂素,既能延缓衰老又不影响植物的生长发育。本研究的目的是探讨PSAG12-IPT导入茄子对衰老和抗性的影响,同时选用磷酸甘露糖异构酶基因PMI作选择基因,取代具有生态风险的抗性基因,为茄子高产育种提供理论基础。主要取得了以下研究成果: 1、建立再生体系 通过对2%有效氯的NaClO溶液浸泡时间对三月茄发芽的影响的探讨,最终确定三月茄种子用75%酒精消毒45S,2%有效氯的NaClO溶液浸泡15min后,播种于1/2MS培养基上获得无菌苗。将14d~16d的三月茄无菌苗在超净工作台上切成三种类型的外植体一子叶、茎尖、下胚轴,下胚轴切成1cm左右长的小段。子叶、茎尖接种在分化培养基上,下胚轴横向平放、正向扦插、反向扦插在分化培养基上,进行再生体系的研究。结果表明,转化三月茄适宜用茎尖、下胚轴正向扦插。 2、优化茄子遗传转化体系 对农杆菌的浸染和转化过程进行了研究,用分化培养基(MS+0.1mg/LIAA+2mg/LZT+3%蔗糖+0.8%琼脂)进行2天预培养,用OD600≈0.8的农杆菌工程菌液浸染10min左右,然后用分化培养基(MS+0.1mg/LIAA+2mg/LZT+3%蔗糖+0.8%琼脂)进行2天共培养,然后在抑菌筛选分化培养基(MS+0.1mg/LIAA+2mg/LZT+400mg/LCef+2%蔗糖+2%甘露糖+0.8%琼脂)中进行40天培养,在生根培养基(1/2MS+400mg/LCef+2%蔗糖+2%甘露糖+0.8%琼脂)中进行20天培养,获得抗性小苗,待根粗壮后炼苗、移栽。 3、抗性植株的分子生物学检测 改良CTAB法提取抗性植株的基因组DNA,根据PMI序列设计引物进行PCR扩增检测。然后根据PMI设计引物,对PCR检测为阳性的植株进行Southern杂交检测,最终得到4棵转基因植株,表明目的基因已经整合到受体植株基因组中,3株以双拷贝形式存在,1株以单拷贝形式存在。RT-PCR检测表明,目的基因在生长旺盛期,只在转基因植株的下部叶片中表达;而进入衰老期后,目的基因在中部叶片和下部叶片中均表达。 4、转基因植株的生物学性状鉴定 对检测为转基因植株进行了生物学性状的调查,结果表明,转基因植株的开花期早于对照,转基因植株高度及开展度均大于对照,结果数及单株产量均高于对照植株。 5、转基因植株进行了生理生化指标鉴定 对获得的转基因植株进行生理生化指标测定,结果表明,转基因植株的叶绿素含量、类胡萝卜素含量、SOD酶活性和POD酶活性均高于对照,而MDA含量低于对照。 6、对转基因植株进行了抗逆性鉴定 对转基因植株的抗逆性鉴定表明,转基因植株在耐衰老性,耐旱性、耐寒性等方面较对照有一定程度的提高。