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烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,TMV)属烟草花叶病毒属(Tobamovirus),是单组分带有帽子结构的正义单链RNA病毒,基因组全长6395bp。病毒RNA由外壳蛋白(Coat Protien,CP)包装成长约300nm,直径约18nm的杆状病毒粒子。TMV系统感染烟草后,CP表达量可达到被感染烟草总蛋白的7%。TMV的CP亚基由4个α螺旋组成,蛋白的N端和C端暴露在外部,选择在CP的N、C端或CP内部的合适位置插入外源序列,通常可使插入的外源序列展示于病毒粒子的外部。因此TMV常被作为外源小肽的表达载体进行研究。我们实验室在TMV病毒载体的研究工作中,成功构建了TMV-F14、TMV-F11、TMV-S1241等重组TMV,表达了来源于不同动物病毒的多种抗原决定多肽,如口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)和SARS冠状病毒等。
随着TMV表达载体的发展,重组TMV的安全性问题越来越受到关注。虽然重组TMV感染性比野生型病毒较弱。然而重组TMV病毒在野外扩散的风险仍然存在。为了解决这一问题,对重组TMV进行灭活处理后再投入使用成为一种安全有效的办法。本文主要使用了β-丙内酯的方法对重组烟草花叶病毒TMV-S1241和TMV-F14进行灭活的研究。β-丙内酯是一种杂环类化合物,其作用机理是能通过与核酸的嘌呤碱基(主要是鸟嘌呤)反应破坏核酸的结构。在β-丙内酯对重组TMV灭活的研究中,发现使用1∶500浓度的β-丙内酯处理72小时,能够将重组烟草花叶病毒TMV-S1241和TMV-F14完全灭活,同时又不破坏TMV-S1241所插入外源小肽的免疫原性。该研究结果表明,β-丙内酯是一种能有效灭活重组TMV的方法。到目前为止,β-丙内酯用于植物病毒的灭活还未有相关报道。这些灭活条件的数据对今后重组TMV病毒的大规模灭活和重组TMV疫苗的生产具有一定的参考价值。
在以TMV为载体表达外源小肽的研究过程中,我们发现并不是所有的重组TMV病毒都能系统感染对野生型TMV敏感的烟草种类。在表达具有抗血栓作用的FX22多肽时,我们发现用融合了FX22多肽序列的重组TMV病毒接种Nicotianatabaccum Samsun nn烟草苗一星期后,接种叶上出现了枯斑症状。这一现象与野生型TMV接种Nicotiana tabacum cv.Samsun NN烟草苗后产生的抗性枯斑很相似。两个星期后Nicotiana tabaccum cv.Samsun nn烟草苗也未形成系统花叶症状。我们推测可能是所插入的外源小肽在蛋白质或核酸的水平上引起了Nicotiana tabaccum cv.Samsun nn烟草苗抗性反应,从而导致了枯斑的产生。