鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是一种上皮细胞的恶性肿瘤。我国是世界上鼻咽癌发病率和死亡率水平较高的国家之一。由于鼻咽癌是一种低分化、高转移性恶性肿瘤,其治疗失败的主要原因仍然为局部区域性复发与远处转移,因而侵袭和转移仍是导致鼻咽癌患者死亡的主要原因。从组织学的角度分析,鼻咽癌绝大部分(95%以上)属于恶性度高的未分化或低分化癌,癌细胞易于扩散转移。故研究鼻咽癌的侵袭机制有重要意义。zeste基因增强子同源物2(Enhancer of Zeste Homolog2,EZH2)是多梳抑制复合物2(Polycomb Repressor Complex 2,PRC2)的核心组分,其高度保守的SET区域具有组蛋白甲基转移酶活性,通过催化靶基因启动子区组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化(Trimethylated lysine 27 of histone H3,H3K27me3),从而抑制基因转录,在染色体水平调控基因活性。有研究表明,EZH2可通过不依赖于其组蛋白甲基转移酶活性的作用影响细胞骨架聚合,从而在肿瘤侵袭转移过程中发挥作用。已发现EZH2在鼻咽癌、前列腺癌和乳腺癌等多种肿瘤组织中过表达,且其表达水平与肿瘤大小、浸润深度、肿瘤分期、淋巴结转移、迁徙及侵袭能力、Rho 相关的卷曲蛋白激酶(Rho-associated coiled-coil containing protein kinase,ROCK)是RhoA的下游效应蛋白,在哺乳动物体内主要有ROCK1和ROCK 2两种异构体。ROCK1蛋白的过表达能够调节细胞骨架的重组、促进应力纤维和点状粘附的形成,从而调节细胞的运动和迁移能力。南蛇藤(Celastrus orbieulatus Thunb),卫矛科南蛇藤属植物。始载于清代《植物名实图考》,又名过山枫、过山龙、黄果藤、香龙草等。我国南蛇藤属植物30种,分布广泛,多野生于山地沟谷、山坡灌木丛中。主要用于治疗风湿性关节炎、痢疾、小儿惊风、跌打损伤、肿毒等病症。南蛇藤含有多种药理成分,如萜类、脂肪类以及苷类等。这些成分具有广泛的药理作用,如抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗微生物以及抗纤维化和抗生育等。特别值得关注的是其在抗肿瘤方面的显著作用。本课题组前期研究显示,南蛇藤茎乙酸乙酯提取物(Corbiculatus ethyl acetate extracts,COE)有显著的抗肿瘤作用,但其机制还未完全阐明。目前已知的南蛇藤茎乙酸乙酯提取物抗肿瘤的机制主要为抑制消化系统肿瘤增殖、侵袭和转移,促进其凋亡,并抑制胃癌细胞上皮间质转化。在本研究中,我们将研究南蛇藤茎乙酸乙酯提取物对鼻咽癌EZH2基因的抑制作用及其对鼻咽癌增殖和侵袭抑制作用的分子机制。研究共分为四部分内容。第一部分鼻咽癌中EZH2、ROCK1蛋白表达及其临床意义目的:确定EZH2、ROCK1蛋白在鼻咽癌中的表达,并评估EZH2、ROCK1蛋白与鼻咽癌的临床病理学特征之间的关系。确定EZH2在鼻咽癌细胞中可以调控ROCK1蛋白的表达。方法:免疫组织化学检测NPC患者病理切片标本中EZH2和ROCK1的表达水平。Western lot及PCR检测慢病毒敲低EZH2表达的人鼻咽癌5-8F细胞(8hEZH2 5-8F)与转染scramble shRNA慢病毒的对照组人鼻咽癌5-8F细胞(shCtrl 5-8F)中ROCK1的表达。结果:对肿瘤病理切片进行免疫组织化学染色,检测肿瘤中EZH2、ROCK1蛋白表达情况及其与临床因素的联系。发现鼻咽癌患者组织中EZH2与ROCK1蛋白表达显著正相关。EZH2蛋白表达水平与患者的T分期、N分期、AJCC分期正相关。ROCK1蛋白表达水平与患者的N分期正相关。Western blot结果表明,shEZH2 5-8F细胞ROCK1蛋白表达显著低于对照组,PCR结果表明,shEZH2 5-8F细胞中ROCK1的表达比shCtrl 5-8F组显著下降。结论:EZH2和ROCK1高表达与鼻咽癌的进展有关。敲低EZH2基因可以抑制鼻咽癌细胞中ROCK1蛋白和基因的表达。靶向EZH2/ROCK1通路可以给鼻咽癌的治疗提供新方向。第二部分EZH2影响鼻咽癌增殖和侵袭的实验研究目的:研究EZH2对5-8F鼻咽癌细胞增殖和侵袭的影响。PCR芯片分析shEZH2 5-8F与shCtrl 5-8F细胞中差异表达的癌基因及抑癌基因。研究EZH2对裸鼠鼻咽癌5-8F细胞皮下移植瘤生长的影响。方法:MTS实验观察增殖能力的改变;Transwell实验检测体外迁移、侵袭能力的变化;裸鼠10只,随机选择5只皮下接种人鼻咽癌细胞株shCtrl 5-8F,其余5只皮下接种人鼻咽癌细胞株shEZH2 5-8F。接种14d后处死老鼠,剥脱肿瘤组织,检测肿瘤体积及重量。PCR芯片比较shEZH2 5-8F与shCtrl 5-8F细胞癌基因及抑癌基因改变。结果:MTS法检测5-8F、shCtrl 5-8F、shEZH2 5-8F细胞种板24、48、72小时后的细胞增殖情况。结果提示shEZH2 5-8F较shCtrl 5-8F增殖能力均明显降低(P<0.05),5-8F与shCtrl 5-8F细胞增殖能力无统计学差异。Transwell小室法检测5-8F、shCtrl 5-8F、shEZH2 5-8F细胞迁移及侵袭(24小时),shEZH2 5-8F较shCtrl 5-8F细胞迁移及侵袭能力降低(P<0.05),5-8F与shCtrl 5-8F细胞迁移及侵袭能力无统计学差异。PCR 芯片结果提示 shEZH2 5-8F 较 shCtrl 5-8F 细胞,APC、ATM、ESR1、MYCN、RET、TGFB1、WT1和ZHX2这8个基因表达上调>3倍,NFKB1和TP53这两个基因下调>3倍。体内研究证实,与阴性对照组相比,shEZH2 5-8F组细胞肿瘤体积显著减小。shEZH25-8F组瘤重显著低于阴性对照组(P<0.05)。结论:EZH2被敲低后能抑制鼻咽癌5-8F细胞增殖、侵袭和迁移,并且可以抑制裸鼠皮下鼻咽癌移植瘤的生长。因此,EZH2可能成为治疗鼻咽癌转移的靶点。其机制可能与其调节癌基因和抑癌基因相关。第三部分南蛇藤提取物通过阻断EZH2/ROCK1通路抑制鼻咽癌细胞增殖和侵袭的体外研究目的:明确南蛇藤提取物(Extract of Celastrus orbiculatus,COE)通过 EZH2/ROCK1信号通路对鼻咽癌细胞的增殖和侵袭具有调控作用,阐明COE在抑制鼻咽癌细胞增殖和侵袭中的作用和机制。方法:鼻咽癌5-8F细胞分别经不同浓度(0,6.25,12.5,25,50及100ug/mL)的COE处理后,MTS法观察增殖能力的改变;流式细胞术检测细胞的凋亡;Transwell实验检测体外迁移和侵袭能力的变化;Westemblot及实时荧光定量PCR法分析EZH2、ROCK1蛋白和基因的表达水平,Westernblot及实时荧光定量PCR实验以EZH2抑制剂(DZNeP)作为阳性对照。结果:不同浓度(0,6.25,12.5,25,50 及 100ug/mL)的 COE 作用 24h,对 5-8F 细胞的增殖有抑制作用,并呈明显的剂量依赖性。药物作用24h时,5-8F细胞在12.5-100 μg/ml浓度组的生长存活率与本细胞对照组相比均有统计学差异(P<0.05);COE对5-8F细胞的半数抑制浓度(IC50)为70.02μg/ml(24h)。不同浓度(0,6.25,12.5,25,50,100μg/ml)COE作用24h可促进5-8F细胞凋亡,并有明显的剂量依赖性。5-8F细胞在100 μg/ml浓度组的凋亡率与对照组相比有统计学差异(P<0.05);因此使用低于100μg/m]浓度的COE进行以下实验,以确保COE对鼻咽癌细胞的作用不是通过直接的细胞毒作用。使用Transwell检测细胞迁移和侵袭。迁移和侵袭实验结果提示不同浓度(12.5,25,50μg/ml)COE作用24h时,5-8F细胞在12.5-50μg/ml浓度组穿过小室的细胞与对照组相比均有统计学差异(P<0.05);并有明显的剂量依赖性。使用 WB 检测不同浓度(0,12.5,25,50μg/ml)COE 或 2μM DZNeP(EZH2 抑制剂)作用24 h后5-8F细胞EZH2和ROCK1蛋白变化。EZH2蛋白在COE 25-50μg/ml浓度组与对照组相比有统计学差异(P<0.05)。ROCK1蛋白在COE 12.5-50μg/ml浓度组与对照组相比均有统计学差异(P<0.05);并有明显的剂量依赖性。COE高剂量组与DZNeP对EZH2、ROCK1蛋白的抑制作用接近。使用 PCR检测 EZH2 和 ROCK1 mRNA变化。不同浓度(0,12.5,25,50μg/ml)COE或 2μM DZNeP 作用 24 h 时,EZH2 和 ROCK1 mRNA 在 12.5-50μg/ml COE 浓度组与对照组相比均有统计学差异(P<0.05);并有明显的剂量依赖性。DZNeP与COE高剂量组对ROCK1 mRNA的抑制作用接近,但DZNeP不能降低EZH2 mRNA的表达量。结论:南蛇藤提取物可通过下调EZH2/ROCK1信号通路抑制鼻咽癌细胞增殖、促进其凋亡,并降低其体外迁移和侵袭的能力。第四部分南蛇藤提取物通过阻断EZH2/ROCK1通路抑制鼻咽癌细胞增殖的体内研究目的:证实COE通过EZH2/ROCK1信号通路对鼻咽癌皮下移植瘤增殖具有调控作用,阐明COE在抑制人鼻咽癌皮下移植瘤增殖中的作用和机制。方法:裸鼠42只,随机选择6只进入正常组,其余36只均于右侧背部皮下接种人鼻咽癌5-8F细胞株。待瘤块直径约5mm-6mm大小时,将裸鼠随机分为对照组(1%DMSO)、COE高、中、低剂量(50,25,12.5mg/kg)组及替吉奥组(10mg/kg),参一胶囊组(10mg/kg),每组6只。分组当天开始给药,COE连续21d,替吉奥连续14d,参一胶囊连续21d,末次药24 h后,检测肿瘤重量,免疫组化检测移植瘤组织内EZH2、ROCK1蛋白表达水平的变化,HE染色检测瘤组织内肿瘤坏死区域。结果:与阴性对照组相比,COE各治疗组肿瘤生长速度减缓。阴性对照组瘤重(1.58±0.74g),COE 低、中、高剂量组平均瘤重分别为 1.36土0.53g,1.26±0.52g 和 0.88士0.53。COE高剂量组移植瘤重量与对照组相比有显著性差异(P<0.05),抑制作用具有剂量依赖性。阳性对照替吉奥组平均瘤重为0.86土0.43g,与COE高剂量组抑制作用接近。中药对照参一胶囊平均瘤重为1.26±0.41g,与COE中剂量组抑制作用接近。使用免疫组化法分别检测鼻咽癌移植瘤组织切片内EZH2、ROCK1蛋白的表达,结果提示COE低、中、高剂量组肿瘤细胞EZH2、ROCK1阳性染色细胞数较阴性对照组下降,抑制作用具有剂量依赖性。表明COE能有效抑制移植瘤组织中EZH2、ROCK1的表达。结论:南蛇藤提取物可通过下调EZH2/ROCK1信号通路抑制裸鼠鼻咽癌移植瘤的生长。