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矽肺病是我国影响面广，危害最严重的职业病之一。矽肺发病机制的研究在流行病调查的基础上已深入到分子水平。生物活性物质、遗传易感性和基因改变等方面的研究近年来成为矽肺研究的热点，从分子水平上认识矽肺的机制更有利于矽肺的防治。 细胞间隙连接通讯（GJIC）是近十年来人们研究得较多的课题。已证明正常细胞在癌基因转染后，细胞的GJIC功能下调，细胞异常增殖。很多促癌剂、致癌剂均可以诱导正常细胞间的间隙连接通讯下调。 本实验室前期的实验证明SiO2刺激肺泡巨噬细胞（AMs）的培养上清液可以诱导成纤维细胞与肺泡上皮细胞的GJIC功能下调，进而细胞异常增殖，同时间隙连接通道的主要结构蛋白Connexin43（Cx43）从细胞膜向细胞核内移。ELISA实验结果表明SiO2刺激AMs的培养上清液并不能改变Cx43蛋白的表达水平。Cx43蛋白的转录、翻译水平下调或降解增强，都会导致蛋白的表达水平降低。因此，我们推断SiO2刺激AMs的培养上清液诱导成纤维细胞及肺泡上皮细胞的GJIC功能下调可能发生在连接蛋白的翻译后水平。 在蛋白的翻译后的加工中，蛋白质磷酸化是敏感而可逆地调节蛋白质功能的一种最常见和最重要的机制，是调节细胞增殖的基础，同时也控制分化和发育。本次实验在前期研究的基础上主要探讨连接蛋白的磷酸化状态与SiO2刺激AMs的培养上清液诱导成纤维细胞及肺泡上皮细胞的GJIC功能下调及Cx43蛋白的内移是否存在内在的联系。 实验分组与方法 1、矽肺体外模型的建立： lj 细胞培养： 中国仓鼠肺成纤维细胞株（CHL）和正常貂肺上皮细胞株（CCL64），均培养 在含10％小牛血清的RPIM1640培养液中，其中含ZmM谷氨酞胺（Lglutamine），lmM 丙酮酸钠（Sodium PyTLlvate），25InM Hepes，常规加入青霉素（100U／ml）、链霉素 （10卜g／ml），放置在 37“C，5％CO。孵箱中培养。 l二大鼠AMS的制备与纯化： 大鼠股动脉放血处死，取支气管和肺进行支气管肺泡灌洗，灌洗液经 1500rpm 离心15min，弃上清，用PBS洗涤三次，合并混匀，加含10O小牛血消的RPMll640 培养基，制备较纯的AMS。 1．3 SIO。刺激AMS细胞培养上清液的制备 将上述制备并纯化的AMS细胞，换入不含小牛血清的opMll640培养基中，根 据培养液所含引0。浓度进行分组：（1）引qopg／m！；（2）引QSO卜g／ml；（）引q 100卜Uml；（4）SIO。200P旮ml；（5）SIO。500P以ml。37”C培养24h后，2500rPm离心 15min，取上清液，经 0二Zpm微孔膜过滤，－70℃保存，备用。 1．4 SIO。刺激AMS细胞培养上清液诱导 CHL细胞和 CCL64细胞 CHL细胞和CCL－64细胞维持于含有10％个牛血清的RPMll640培养液中常规 培养，培养 4天。培养结束前 24h，换加 2％小牛血清的 RPMll640培养液，并按实 验分组： 空白对照组，加入5％（V／V）含2％小牛血清的RPMI 1640培养液； SIOZ刺激 AMS的培养上清液作用组：分别加入 5％（V／v）的 0、50、100、200、 500pg／ml SIO。刺激 AMs的培养上清液，作用 24h。 TPA阳性对照组：在空白对照组培养的最后 lh加入 sng／ml的 12－O－四葵酞基－ 佛波－13－乙酸酯（12－O－tetradecanoylphorbol－13－aCetate，TPA）。 CHL细胞的 PKC抑制剂组：裂解前 24hsiOZ刺激 AMS的培养上清液作用组（0， 500卜yml SO。），同时加入 5％的 AMs上清液及 0刀1％（w／v）的十六酞基肉毒碱 （Palmitoyl－DL－Carnitine chloride，PMC）：裂解前＊ ，TPA阳性对照组同时加入 sng／ml 的 TPA及 0．of％（v／v）的 PMC。 2 2、经8。刺激AMS的培养上清液诱导的CHL细胞、CCL－64细胞的CX43磷酸化 状态的测定： 2刁细胞蛋白提取【小 细胞膜蛋白的提取。培养于10（）m培养瓶中的CHL细胞及CCL－64细胞，用预 冷的 PBS洗三次；加入 375pl三羟甲基氨基甲烷（Tris）－碘乙酞胺（iodoacetamide， IAA）－苯甲基磺酞氟化物（PMSF）缓冲液，然后加 550pl 40mM NaOH，刮下细胞， 超声（3次，每次10s，强度为40W）；4”C、14000rpm离心15min；取沉淀，用 Tris－IAA－PMSF缓冲液洗两次后溶于0三ml TriS－PMSF液中，加入33卜120％的十二烷 基硫酸钠（SDS）后，用 F