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研究背景:高三尖杉碱酯(Homoharringtonine, cephalotaxine,4-methyl2-hydroxy-4-meth-ylpentyl butanedioate [ester],简称HHT,别名高粗榧碱)是从我国特有三尖杉属植物海南粗榧(Cephalotaxus harringtonia)(常绿乔木)中分离得到的天然生物碱,在纳摩尔(nanomolar concentration, nM)浓度就能杀伤肿瘤细胞,是一种非常有效的抗癌剂。在中国,HHT被用来作为急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)联合化疗方案的一个关键组成部分,广泛使用已经超过30年。最近的一项多中心、开放、随机对照的III期临床试验显示,对于原发性AML患者,基于HHT的诱导方案HAA(高三尖杉酯碱+阿糖胞苷+阿柔比星)取得了较高(73%)的完全缓解率(complete remi ssion rate, CR),显着高于目前治疗AML的国际标准方案(柔红霉素联合阿糖胞苷)的57.3%;并且其3年无事件生存率(3-year event-free survival)为35.4%比23.1%,从而成为原发性AML的标准诱导缓解方案。然而,临床上不同白血病患者对HHT的治疗反应是迥然不同的。HHT对部分患者有良好的治疗效果,能达到完全缓解,但也有一部分患者不但没有收到疗效,甚至出现了骨髓抑制等严重后果。因此,寻找HHT抗白血病作用的分子靶标,并阐明其作用的具体分子机制无疑有助于最大限度发挥HHT抗白血病作用并减少HHT相关的毒副作用。以往一些研究认为核糖体是HHT介导的蛋白质翻译抑制的候选靶标之一,其主要依据是晶体结构研究。该研究显示HHT与氨基酸侧链的氨酰基-tRNA相竞争,结合在核糖体的肽基转移酶中心的A位。然而,在此共结晶结构模型中使用的HHT浓度为1毫摩尔(mM),这是HHT用于杀伤肿瘤细胞nM浓度的10万倍,提示HHT结合到核糖体的亲和力可能不高。不排除在这一高浓度下,HHT非特异性结合到核糖体的可能。此外,如果核糖体是HHT的一个关键靶标,HHT处理后应抑制全部蛋白质的合成。然而,文献研究发现HHT选择性地抑制一些半衰期短的致癌蛋白的合成,c-Myc, cyclin-D1, Mcl-1等,但对管家基因编码的蛋白质,如GAPDH和β-actin并没有明显影响,这是核糖体作为HHT的主要靶分子所不能解释的。因此,我们推测尚有未知的关键的分子靶标可能参与HHT介导的抗肿瘤活性。文献报道指出,真核翻译起始因子4E(eukaryotic translation initiation factor4E, eIF4E)在具有短半衰期的致癌蛋白或者促生存蛋白的mRNAs转运过程中发挥了关键性的作用;并且在AML-M5患者中eIF4E过表达。巧合的是,我们最近的研究发现p-eIF4E水平在AML-M5患者中高度上调。结合既往的研究结果,使我们有理由相信HHT可能通过作用于p-eIF4E发挥抑制白血病细胞增殖的作用。本研究中,我们首先应用生物素标记的HHT分离和鉴定可能与HHT作用的eIF4E和p-eIF4E蛋白质分子靶标,然后通过系列体外和小鼠体内实验手段和方法系统研究HHT与其靶标之间相互作用的分子机制,为明确HHT临床应用的适应症提供科学理论依据。研究目的:1、分离和鉴定高三尖杉碱酯抗急性髓系白血病作用的分子靶标;2、初步阐明高三尖杉碱酯与其分子靶标p-eIF4E相互作用的分子机制;3、明确高三尖杉碱酯对高表达分子靶标p-eIF4E的入急性髓系白血病细胞在小鼠体内的生长抑制作用;4、明确高三尖杉碱酯分子靶标p-eIF4E在人髓系白血病原代样本及正常血细胞样本中的表达情况。研究内容与结果:1. p-eIF4E是HHT抗急性髓系白血病活性的一个关键靶标为了明确HHT是否特异性地影响AML细胞中的p-eIF4E水平,通过Western blotting检测HHT对p-eIF4E和t-eIF4E的作用。用HHT处理AML-M5细胞系THP-1白血病细胞24小时导致p-eIF4E水平的抑制,呈剂量依赖,而t-eIF4E水平则不受影响。同样,在原代AML细胞中也观察到了类似结果。并且HHT对p-eIF4E水平的影响呈时间依赖。为观察HHT是否存在抑制其他信号分子的脱靶效应,我们检测HHT对MNKl和Mcl-1的抑制作用。在显着抑制eIF4E磷酸化的浓度,HHT对磷酸化的MNK1没有明显的影响,而Mcl-1的水平则表现出与p-eIF4E平行的下降,表明p-eIF4E水平的下降不是非特异性毒性作用的结果。上述结果有力地表明HHT特异性地降低p-eIF4E及其下游靶蛋白Mcl-1。为了评估HHT介导的p-eIF4E的减少是否与其抗白血病活性有关,通过MTT试验和Western blotting技术来研究细胞存活率和p-eIF4E蛋白下降的关系。我们用一定浓度的HHT作用THP-1细胞48小时,可以观察到HHT介导的抗白血病活性和p-eIF4E抑制呈正相关,相关系数为0.87。为了进一步证实上述结果,接下来我们选择了6个具有不同的抑制细胞增殖能力的HHT结构类似物,分别检测其在THP-1细胞的抗增殖活性和p-eIF4E的抑制作用,发现HHT类似物抗细胞增殖的IC50值和p-eIF4E的抑制是显着相关的,相关系数为0.98。这些结果强有力地说明HHT可能是抑制白血病细胞生长的特异的p-eIF4E的拮抗剂。2. HHT特异性下调白血病细胞p-eIF4E水平为了确认上述实验结果,我们采用生物素标记的HHT (HHT-biotin)来捕获白血病细胞中的p-eIF4E蛋白和eIF4E蛋白。采用THP-1细胞的全细胞裂解产物与HHT-biotin孵育,然后用亲和素磁珠来沉淀与HHT-biotin相互作用的蛋白分子复合物。经过充分的洗涤,在沉淀产物中检测到p-eIF4E和t-eIF4E.与此相一致的是,我们通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色实验检测到p-eIF4E蛋白条带,并通过Western blotting和蛋白质谱分析(Mass Spectroscopic analysis)得到确认。为了检测纯化的p-eIF4E蛋白是否与HHT相互作用,进一步通过pull-down实验证实HHT-biotin是结合到p-eIF4E蛋白的。为了揭示在白血病细胞中HHT结合p-eIF4E的细胞定位,用生物素标记的HHT(HHT-biotin)、生物素(biotin)和HHT作用THP-1细胞12小时,通过p-eIF4E抗体的免疫荧光染色,观察其与HHT-biotin的共定位情况。结果显示HHT-biotin在整个细胞浆和细胞核内均有分布,但主要定位于核p-eIF4E.为了进一步验证上述实验结果,我们用HHT(100ng/ml)作用THP-1细胞12h或者24h,通过免疫荧光染色来评估p-eIF4E和t-eIF4E在白血病细胞的分布。结果显示HHT作用12小时,核p-eIF4E水平大大减少,在24小时基本消失,但t-eIF4E无明显影响。并且我们还观察到,伴随核p-eIF4E的消失,HHT促进核p-eIF4E在细胞核周边和胞浆的聚集。Western blotting实验也显示HHT作用能显着降低THP-1细胞核p-eIF4E水平。这些研究结果表明,在白血病细胞,HHT主要结合于p-eIF4E,特别是核p-eIF4E。3. p-eIF4E209位磷酸化丝氨酸是HHT结合的关键位点之一为了揭示HHT结合p-eIF4E的潜在结合位点,通过计算机分子对接模型,我们发现201a.a.到212a.a.是HHT结合eIF4E的关键位点。我们模拟了25纳秒(ns)时磷酸化S209(p-eIF4E)、磷酸化S209-敲除(eIF4E-△209S)与HHT的相互作用,结果显示为了获得更强的蛋白-配体相互作用,p-eIF4E中的环区移向HHT分子,K206的重要组成部分氧原子与HHT分子形成氢键。另一方面,在eIF4E-△209S内的环区因为局部螺旋的形成而失去其灵活性,因此它与HHT分子的结合力是比较弱的。这可以通过检查环区与HHT的最小距离来进一步说明。模拟p-eIF4E、 eIF4E和eIF4EA209S在0-25ns与HHT的相互作用,我们发现这个环区是灵活的,并且最终在17ns时p-eIF4E与HHT形成紧密而稳定的作用,两者的最小距离为2.8A;然而对于eIF4E-△209S的模拟显示,该环区始终远离HHT分子,距离达到8A;对于eIF4E,也没有观察到其与HHT稳定的相互作用。上述分子对接模型结果表明,相比于eIF4E-△209S和eIF4E, p-eIF4E蛋白对HHT具有更大的亲和力。为了鉴定HHT结合eIF4E的具体氨基酸位点,我们构建了一系列eIF4E的突变体,包括W56,W73,W102和Ser209缺失的突变体,通过转染HEK293细胞检测HHT结合到这些突变体的能力。选择这些突变体的主要原因是W73与泛素/降解相关,W56和W102涉及帽结合活性,而S209则是其磷酸化位点。结果显示,Ser209缺失的突变体消除了eIF4E与HHT的结合,这与上述计算机模拟结果一致,而其他氨基酸残基的突变,包括eIF4E56W,73W和102W缺失,并不影响eIF4E与HHT的结合。这些结果表明磷酸化Ser209位点是HHT结合eIF4E的关键,并且p-eIF4E与HHT结合的亲和力远高于eIF4E.4.HHT通过增加SUMO化促进蛋白酶体依赖的p-eIF4E蛋白降解已知eIF4E是小泛素化蛋白(SUMO)底物之一。为明确SUMO化修饰是否参与HHT介导的p-eIF4E的下降,我们评估了白血病细胞中HHT对p-eIF4E和SUMO结合酶UBC9的影响。结果显示,HHT处理THP-1细胞3小时,p-eIF4E从细胞裂解液的上清转移到不溶性颗粒,伴随出现UBC9的增加。HHT处理24小时后,大部分的p-eIF4E从上清液转移到不溶性颗粒,提示HHT增加p-eIF4E在髓系白血病细胞中的变性水平。这些结果与免疫荧光观察到的结果即HHT诱导p-eIF4E在细胞核周边和胞浆的聚集相一致。进一步,我们发现蛋白酶体抑制剂MG132强烈阻止白血病细胞中HHT诱导的p-eIF4E蛋白水平的下降,提示HHT可能触发p-eIF4E的蛋白酶体依赖的降解。接下来我们研究HHT是否通过增加SUMO化使p-eIF4E变性?使用HEK293细胞转染表达FALG-eIF4E、FALG-eIF4E-△209S的质粒,然后用/不用HHT处理12h。细胞裂解物用抗FALG M2磁珠进行免疫沉淀,随后用anti-SUMO1、anti-SUMO2/3或者anti-FALG抗体通过western blotting技术进行分析。结果显示:HHT处理后,用anti-SUMO2/3抗体检测,发现野生型eIF4E在25kDa以上有多条条带,但是在eIF4E-△209S突变却未检测到;而且无法用anti-SUMO1抗体检测到上述条带,并且HHT (100ng/ml)增加了SUMO化p-eIF4E的寡聚化。这些结果表明HHT处理增加了SUMO2/3介导的p-eIF4E的SUMO化。此外,Ser209的磷酸化是HHT介导的p-eIF4E的SUMO化的关键。为了进一步明确上述结果,在白血病细胞中,我们对HHT诱导的UBC9结合到p-eIF4E的水平做进一步的分析,发现HHT增加UBC9结合到p-eIF4E,呈时间依赖。这些结果表明,HHT诱导SUMO2/3分子介导的p-eIF4E蛋白的SUMO化,通过增加UBC9与p-eIF4E的亲和力,这反过来导致p-eIF4E蛋白酶体依赖的降解。因此,我们提出HHT诱导p-eIF4E降解的工作模型:HHT特异性结合到p-eIF4E的201-212a.a.,导致构象变化,这有利于p-eIF4E的寡聚化和SUMO化,最终导致蛋白酶体依赖的降解。5. HHT对p-eIF4E高表达的人AML-M5原位小鼠移植瘤的生长抑制作用为了获得HHT根除p-eIF4E高表达的AML细胞的体内证据,我们把表达高水平p-eIF4E的THP-1细胞注射到NSG小鼠体内,建立了具有侵袭性的人AML-M5原位小鼠模型。每天按0.5mg或1.0mg/kg体重的HHT剂量腹腔给药,1天1次,连续14天。经过HHT处理大大降低了白血病负荷,并且生存时间延长,呈现剂量依赖。用高剂量HHT(1.0mg/kg体重)可以完全根除小鼠体内的AML-M5细胞,且到80天时所有小鼠仍处于无病生存。这些结果表明HHT结合于p-eIF4E,使其具有根除表达高水平p-eIF4E的AML的潜能。6. p-eIF4E在部分AML患者中异常上调,而在正常个体中未见表达或低表达已有文献指出eIF4E在部分白血病患者中是高表达的,但p-eIF4E在人急性髓系白血病患者中是否表达目前未见任何报道。因此,我们通过western blotting技术检测了7例人AML细胞系,16例不同的AML原代样本,20例健康成年捐赠的正常造血细胞样品中的p-eIF4E和eIF4E蛋白水平。结果显示7例AML细胞均表达高水平的p-eIF4E和eIF4E蛋白,16例原代样本中有13例(81.25%)表达高水平的p-eIF4E和eIF4E蛋白,但在20例健康成年中,8例表达低水平的p-eIF4E蛋白,12例不表达p-eIF4E蛋白。上述结果表明,相比于正常个体,p-eIF4E蛋白水平在部分AML患者中是高度上调的。研究结论:1. p-eIF4E是HHT抗急性髓系白血病作用的重要靶标之一;2. p-eIF4E丝氨酸209位磷酸化是HHT结合的关键位点之一;3. HHT通过增强SUMO化途径促进p-eIF4E进行蛋白酶体依赖的降解;4.HHT能清除原位NSG小鼠模型体内高表达p-eIF4E的人急性单核细胞白血病细胞;5. p-eIF4E在部分急性髓系白血病患者原代白血病细胞样本中呈高表达状态。