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目的:有机磷化合物是20世纪初被开发的主要用作杀虫剂来保护农作物[1]。急性有机磷中毒是急诊科常见的中毒之一,主要的中毒途径包括经口和呼吸道吸入和摄入以及皮肤接触[2]。多数的有机磷中毒患者来自职业暴露和自杀[3,4]。有机磷中毒对肝,肺,肾,大脑和心脏具有广泛的毒性作用[8]。有机磷中毒目前已知的机制是抑制胆碱脂酶的活性,引起突触后膜上的乙酰胆碱的大量聚集,过量的乙酰胆碱会导致严重的毒性,刺激毒蕈碱样和烟碱样受体,引起胆碱能综合征(24h内),出现腹泻、尿失禁、瞳孔变小、心动缓慢、支气管平滑肌痉挛、留涎、恶心呕吐,血压下降等毒蕈碱样症状以及肌束震颤、全身横纹肌肌无力、血压升高、心跳加快、大汗、瞳孔变大等烟碱样症状[5,6]。随后在严格治疗期还可能发生中间综合症(IMS)(24h-7d),出现呼吸肌、极端肌肉、颈部屈肌、运动颅神经的麻痹和神经肌肉接头(NMJ)功能障碍以及由于神经靶向酯酶(NET)的抑制和老化发生延迟性神经病变(OPIDN)(7-21d)[7]。在有机磷中毒的早期,在过去的六十年来,有机磷中毒患者的临床护理几乎没有改善,目前临床用于治疗有机磷中毒的药物仍然是是阿托品和肟类[9]。但是这两种治疗药物的缺点也很明显。阿托品使用过量会导致心动过速,高热,谵妄和肠道功能障碍出现麻痹型肠梗阻[10],至今尚无明确的阿托品理想剂量方案,而对肟类在有机磷中毒治疗的解毒效果也存在讨论和质疑,肟类不能保护和重新激活中枢神经系统的乙酰胆碱酯酶[11]。目前认为这种治疗方法是不理想和不充分的。在这种情况下,急需一种更加高效的,毒副作用小的新型药物来治疗有机磷中毒。1953年,Mazur等人在哺乳动物的身体里发现了这个酶,它可以水解有机磷化合物对氧磷[12,13],所以把它叫做对氧磷酶1(PON1)。它对许多有机磷农药有水解作用,所以获得了广泛的研究和关注。PON1是一种钙离子依赖性酶,由354个氨基酸组成,分子量约为43KDa[14]。PON1主要在人体的肝脏中产生,释放入血液,因为它在N末端区域有疏水信号序列,所以能够与HDL结合[15],发挥多种功能,包括阻止低密度脂蛋白的氧化,从而减少动脉粥样硬化斑块的发展,以及各种OP化合物的解毒作用[16]。免疫组化研究发现,PON1存在于哺乳动物体内很多的组织中,但是是由组织自身合成,还是通过HDL运输到组织还不得而知[17]。人类的PON1基因是在第7号染色体上(7q21.3-22.1),呈六叶螺旋桨结构,编码去有9个外显子、8个内含子[18]。在不同人体内的PON1水平差异很大,这是由于PON1的基因多态性决定的。编码区域中的PON1-Q192R等位基因主要决定PON1的催化活性,编码区域中的PON1-L55M多态性以及启动子区域的PON1-T108C多态性主要决定PON1的表达水平[19]。此外,不同PON1基因型的个体对于不同有机磷化合物的中毒易感性是有差异的。研究表明PON1的192号位点的Q/R两种基因亚型对于不同种类的有机磷化合物的水解效果是有差异的[20]。在之前的实验中,我们通过基因工程技术,利用E.coli作为表达系统制备了重组人PON1192Q亚型[21]。但是这种原核细胞表达系统生产出来的重组PON1的产量和活性都比较低,而且在表达时,这些重组蛋白会形聚集成包涵体,需要通过复性才能重新获得活性[22,23]。但是在复性时,又会有重组蛋白损失,严重影响了表达量和活性。其次,原核系统表达重组蛋白没有翻译后的修饰功能[24]。影响了重组蛋白的的结构和功能,会使蛋白的活性受到影响甚至完全改变[25]。通过前期的研究,我们发现杆状病毒-昆虫细胞的大规模悬浮培养是一种非常高效的真核细胞蛋白表达体系。利用含PON1基因的重组杆状病毒转染和培养昆虫细胞[27],可以在生物反应器中对目的基因进行大规模的表达。其蛋白表达效率高,产量大,酶活性稳定,是一种非常理想的表达体系[28]。但是在实际制备的过程中,重组PON1的产量和活性虽然较之前的报道有所提升,但是仍不能满足后续试验的需求,因为在实际的试验中我们发现,杆状病毒表达载体系统(BEVS)是在昆虫细胞中生产重组蛋白的瞬时表达平台。杆状病毒感染昆虫细胞将切断宿主翻译并诱导凋亡,并导致蛋白质表达终止。这使得表达目的蛋白局限于转染后的1-3天,严重影响了目的蛋白的产量。如何提高重组蛋白过表达的产量和活性成为了一个突破的关键点。需要对昆虫细胞-杆状病毒表达体系进行改良,从而获得更多,活性更好的重组PON1。而且PON1192Q/R对不同类型的有机磷毒物的解毒作用缺乏系统性的研究[26]。在实验过程中发现,PON1192R对敌敌畏和乐果的水解效果好于PON1192Q。PON1192Q对敌百虫的水解效果要好于PON1192R。PON1192Q/R两种基因亚型同工酶对不同有机磷化合物表现出截然相反的水解效果。而PON1192Q/R对三硫磷的水解效果都非常差,几乎没有水解效果。通过对这四种有机磷化合物的化学结构进行对比,发现他们四个之间有一定差异。在同一位置处,敌敌畏和敌百虫的化学结构中含有P-O键,而乐果和三硫磷的化学结构中含有P-S键甚至是P=S双键。P-S键本身要比P-O键牢固,不易断开。这可能是rhPON1192Q/R难水解甚至不水解含P-S键的有机磷化合物的原因之一。因此本实验研究拟通过利用RNAi干扰技术,构建包含Sf-caspase-1反向重复序列的重组杆状病毒pIBds Casp-1,然后转染SF21细胞,对宿主细胞进行改造,培养出RNAi介导的Sf-caspase-1抑制的稳定细胞。抑制宿主细胞内SF-Caspase-1的表达,提高SF细胞对凋亡的抗性,延迟细胞死亡和溶解,提高重组蛋白表达的产量和蛋白的活性。然后使用碱性磷酸酶对PON1192Q/R去磷酸化,证明磷酸化对PON1192Q/R的重要性[29]。同时对四种有机磷化合物按照化学结构中含有P-O键和P-S键进行分类,比较PON1192Q/R对含P-O键和P-S的有机磷化合物的水解效果的差异。初步证明PON1192Q/R对含P-O的有机化合物的水解效果要好于含P-S键的有机磷化合物。然后通过动物实验进一步证明rhPON1192Q/R对不同类别有机磷化合物(含P-S键和含P-S键)的解毒效果的差异。并对PON1192 Q/R水解有机磷化合物的不同机制展开了研究。研究方案:1、对昆虫细胞-杆状病毒表达体系的优化。构建重组杆状病毒pIBds Casp载体。使用pIB载体作为骨架构建稳定的转染质粒。通过聚合酶链反应(PCR)从Sf21细胞提取的基因组DNA中扩增Sf-caspase-1基因的5’端800个碱基对(bp)正向和反向DNA片段。产生的构建体名为pIBds Casp,包含在opIE2启动子控制下的Sf-casp1的反向重复序列。经过20次传代后,通过基因组DNA PCR和RT-PCR分析稳定的细胞系,以检查Sf-caspase-1的反向重复DNA序列和内源表达的Sf-caspase-1 m RNA的量。确定形成稳定的SF21细胞系。然后用携带目的基因PON1的重组杆状病毒p Bac PKA8转染改造后的稳定SF21细胞系,经过6天的培养,最后采用镍柱层析的方法,回收蛋白并进行纯化。通过分光光度法对目的蛋白进行活性的检测和比较。2、研究磷酸化对保持rhPON1192R/Q亚型同工酶活性的重要性,以及rhPON1192Q/R的底物特异性差异。使用碱性磷酸酶对rhPON1R192、rhPON1Q192和人混合血清(h PON1mix)进行去磷酸化反应。选取我国最常使用的三种标志性有机磷农药:敌敌畏、乐果、敌百虫、三硫磷为底物分成四组,研究去磷酸化前后,rhPON1192Q/R对上述四种有机磷底物的体外水解效果的差异。探索翻译后修饰对rhPON1192Q/R保持活性和底物特异性的重要作用。然后按照含P-O键和含P-S键将有机磷化合物分成两组,初步证明rhPON1192Q/R对含P-O键的有机磷化合物的解毒效果要好于含P-S键的有机磷化合物。3、通过动物实验,进一步证明rhPON1192Q/R对含P-O键的有机磷化合物的解毒效果要好于含P-S键的有机磷化合物,同时研究rhPON1的Q/R两种基因亚型同工酶对有机磷中毒大鼠肺损伤的保护作用机制。144只SD大鼠随机分成敌敌畏染毒A组、敌百虫染毒B组、乐果染毒C组。再将各组分成四个亚组,染毒组、PON1192Q治疗组、PON1192R治疗组、生理盐水对照组。每个亚组12只。构建有机磷中毒大鼠的模型。治疗组在染毒后立即腹腔注射15U/kgrhPON1192Q/R来作为解毒药物。观察大鼠出现有机磷中毒症状的时间。在染毒后12小时作为实验终点。选择右上肺叶组织浸泡在10%甲醛,用于后续的HE染色。选择左肺叶组织在-80℃冻存用于后续的western blot。结果:1、通过对改良后的SF21细胞进行PCR和RT-PCR,结果显示pIBds Casp载体已与Sf21细胞基因组DNA稳定整合。此外,数据还显示Sf21/pIBds Casp-1细胞中Sf-Casp1 m RNA的水平明显低于Sf21和Sf21/pIB细胞中观察到的水平。Sf-caspase-1 ds RNA在Sf21/pIBds Casp-1细胞中成功抑制了Sf-caspase-1 m RNA的表达。2、使用rhPON1 192Q-P2-Vir和rhPON1 192R-P2-Vir病毒液分别以0.1、1、10的感染复数(MOI)感染sf21,Sf 21/pIB和Sf 21/pIBds Casp-1细胞。在2-4 dpi时,在所有MOI中,r Bac SEAP感染的Sf21/pIBds Casp-1细胞中的重组PON1累积表达明显高于对照组。当MOI为1和10时,在4 dpi后感染病毒液的的Sf21/pIBds Casp-1细胞中的重组PON1累积表达比对照组高约2倍。正常和Sf-caspase-1抑制的稳定细胞之间累积重组PON1表达的差异随MOI的增加而增加。这些数据表明,杆状病毒感染后,Sf-caspase-1抑制的稳定细胞分泌的重组蛋白PON1产量高于正常SF21细胞。MOI=10时,重组PON1的表达时间早、表达累积量高、24h表达量高。3、PON1192Q/R对有机磷化合物水解活性存在差异,PON1192R对敌敌畏和乐果水解效果更好,而PON1192Q对敌百虫的水解效果更好。但是对乐果的水解活性明显弱于敌敌畏和敌百虫。在去磷酸化之后,各组的水解活性都出现了明显的下降,但是和去磷酸化之前显示出同样的底物特异性,显示出磷酸化对于保持重组蛋白的活性具有重要作用。4、通过对敌敌畏、敌百虫、乐果、的化学性质和分子结构进行比对,发现他们的分子结构有一定的差异。敌敌畏和敌百虫的分子结构中含有P-O键,而三硫磷和乐果的分子结构中含有P-S键。三硫磷和乐果的化学性质比较稳定,与它们含有P-S键有关。证明PON1192Q/R对含P-O键的有机磷化合物的水解效果要优于含P-S键的有机磷化合物。5、动物实验比较重组PON1在体内对敌敌畏,敌百虫和三硫磷的解毒效果的差异,结果发现PON1两种基因亚型同工酶对不同类别的有机磷化合物的水解效果可能完全相反。PON1 192R对敌敌畏的水解效果要好于PON1 192Q,而PON1 192R对敌百虫的水解效果要弱于PON1 192Q。6、从肺组织HE染色结果可以看到,敌敌畏、敌百虫、乐果染毒组出现明显的肺组织充血,肺泡出血,肺泡间隔变宽,肺泡壁塌陷和大量的炎症细胞浸润。rhPON1 192 Q/R治疗组的肺水肿、肺泡间隔肿胀明显减轻,炎性细胞减少。血清和肺组织匀浆AchE活性结果显示,与对照组相比,染毒组的AchE活性明显下降,而rhPON1 192 Q/R治疗组的AchE活性较染毒组有了明显提高。肺组织中SOD、GSH-Px、MDA水平结果显示,与对照组相比,染毒组的SOD、GSH-Px下降明显,MDA增多,而rhPON1192 Q/R治疗组的SOD水平较染毒组有了明显升高,同时MDA水平下降。这些结果说明rhPON1192 R/Q不仅可以通过我们熟知的胆碱能机制,提高肺组织中AchE活性水平来保护有机磷中毒引起的肺损伤,同时还可以通过非胆碱能机制,作为一种抗氧化剂,减轻了有机磷中毒引起的氧化应激损伤,起到保护肺组织的作用。同时进一步证明rhPON1 192Q/R对含P-O键的有机磷化合物的解毒效果要好于含P-S键的有机磷化合物。结论:1、使用RNA干扰技术可以获得Sf-caspase-1抑制的稳定SF21细胞。在感染后2天和3天,细胞凋亡的抑制作用增强了重组PON1蛋白的产量。感染后5天,与不使用si RNA改造的细胞系相比,Sf-caspase-1抑制的稳定SF21细胞中蛋白的活性仍然更高,目的蛋白产量也更高。2、去磷酸化前后rhPON1 192 Q/R底物特异性依然存在,但是酶的活性出现了明显的下降。3、rhPON1192Q/R对含P-O键的有机磷化合物的水解效果要好于含P-S键的有机磷化合物。在大鼠体内,rhPON1192Q/R对含P-O键的有机磷中毒的解毒效果要好于含P-S键的有机磷化合物中毒。4、rhPON1192Q/R对不同种类的有机磷中毒大鼠的肺组织具有保护作用。作用的机制可以总结为两种。一种是胆碱能机制,通过减轻有机磷化合物对血清和肺组织的胆碱酯酶的抑制,提高肺的动静态顺应性和通气血流比例,起到保护肺组织的作用;第二种是氧化应激机制,PON1作为一种抗氧化剂,减轻了有机磷中毒引起的氧化应激损伤,保护了肺组织。5、PON1192Q/R对含P-O键的有机磷毒物的解毒效果要好于含P-S键的有机磷毒物。