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菊芋(Helianthus Tuberosus L.)又称洋姜、鬼子姜,其块茎富含果聚糖等营养物质。通常菊芋块茎表皮呈白色,而有些品种表皮花青素含量聚集产生有色表型。其中高花青素含量不仅有利于菊芋提高抗逆性能,同时也是一种特殊的分子遗传标记。目前,调控菊芋块茎表皮花青素生物合成关键基因未见报道,相关分子机制尚不明确。本研究选用QY1(紫色表皮)和QY3(白色表皮)菊芋品种为材料,利用RNA-seq技术比较分析紫皮菊芋和白皮菊芋表皮中所有转录本的表达差异,筛选出控制紫色表皮性状的候选基因,并进行分离克隆及功能验证,为解析菊芋有色表皮性状奠定可靠的分子遗传基础。主要研究结果如下:(1)RNA-seq技术对紫皮菊芋(QY1)和白皮菊芋(QY3)的表皮进行测序。对测序得到的Clean data和Raw data进行组装拼接,三次重复后共获得50.04GB原始数据以及333.72Mb的读数,拼接得到197769个Unigenes,平均长度1140bp,共注释到164780个单基因。55354个Unigenes在白、紫皮菊芋中差异表达,其中28113个Unigenes在紫色表皮中表达量上调,27241个Unigenes表达下调。所有与花青素生物合成相关的结构基因在紫色表皮中表达量均高于白色表皮。调控花青素合成代谢的MYB转录因子Unigene44371＿All(Ht MYB2)在紫色表皮中表达量log2Fold Change值达到8.07,在白色表皮中几乎不表达,因此预测Ht MYB2就是主要调控紫色菊芋表皮花青素合成的候选基因。RT-PCR显示参与调控花青素生物合成的结构基因多数上调,其中CHS、F3H、DFR基因在紫色表皮中上调差异较大,实验结果与转录组数据相符。(2)Ht MYB2基因全长1066bp,CDS长度为744bp,编码246个氨基酸,基因序列包含2个内含子和3个外显子。在QY1和QY3中Ht MYB2的基因组序列和编码序列完全相同。序列分析显示Ht MYB2为亲水性蛋白。系统发育树中Ht MYB2基因与调节向日葵花青素生物合成的Ha MYB90基因遗传关系最近。Ht MYB2具有完整的SANT/MYB Domain和MYB-like DNA-binding结构域。(3)构建植物过量表达载体PJAM1502-Ht MYB2,利用农杆菌介导的方式获得过量表达Ht MYB2烟草转基因系,得到紫色表型转基因烟草。花青素测定显示转基因株系花青素含量明显高于野生型烟草。转基因紫色烟草中所有参与花青素合成的结构基因表达量均显著上调,DFR上调最显著,Ht MYB2表达量差异较显著。根、茎、叶、花和块茎表皮中均有不同程度的花青素积累,并且QY1的根和块茎表皮中的花青素含量明显高于QY3。Ht MYB2基因在QY1的根和块茎表皮中的表达量显著高于QY3,其表达丰度与花青素在不同组织中的浓度一致。(4)利用TAIL-PCR从QY1和QY3中分离到的Ht MYB2上游启动子片段,大小分别为1487bp(Ht MYB2p)和1508bp(Ht MYB2w)。其中QY3较QY1启动子在-1360bp～-1342bp多出21个核苷酸序列。对启动子进行GUS瞬时表达验证得出,Ht MYB2p活性比Ht MYB2w更强。以21bp差异设计等位变异引物,在紫色和白色各90份的自然群体中进行等位变异扫描发现所有紫色表皮都具有Ht MYB2p特性。