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双果糖酐I(α-D-fructofuranose-2′,1:2,1′-β-D-fructofuranose dianhydride,DFA I)是由两个果糖所组成的环状二糖,在自然界含量极为稀少,它甜度较高,能量值很低,与益生元双果糖酐III(α-D-fructofuranose-2′,1:2,3′-β-D-fructofuranose dianhydride,DFA III)是同分异构体,可能具有类似DFA III的生理功能,但是有关DFA I的确切生理功能报道很少。DFA I的低产量(即意味着没有大量及廉价的原材料)可能是导致这一研究较少的原因。目前,生物法合成DFA I是一种转化率高,副产物少,经济可行的方法。尤其是利用菊糖果糖转移酶(inulin fructotransferase,IFTase(DFA I-forming))水解廉价菊糖生成DFA I方法具有极大的可行性。实验室保存的一株链霉菌S.davawensis SK 39.001,其能够利用菊糖为唯一的碳源来合成DFA I,说明S.davawensis SK 39.001可能含有将菊糖转化为DFA I的IFTase(DFA I-forming)。利用基因工程手段调取出其中可能的IFTase(DFA I-forming)的基因片段(全长1,179 bp),将目的基因片段连接在表达载体pET-22b(+)上,构建重组质粒。将重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)的感受态细胞中,并使用IPTG诱导过量表达蛋白,经鉴定,分离纯化后的SdIFTase能够转化菊糖生成DFA I,说明S.davawensis SK 39.001中确实具有IFTase(DFA I-forming)。本文对SdIFTase(SDS-PAGE鉴定其亚基的相对分子质量大小为40,000)的酶学性质进行研究,发现重组酶最适pH为5.5,最适温度为40°C;该重组酶热稳定性适中,在70°C下保温30 min有50%以上的酶活;当以菊糖为底物时,Km值为2.89 mmol/L;当底物菊糖的浓度分别为10、50和100 g/L时,反应2 h后,且其转化率分别为81%、69%和51%;该重组酶的最小作用底物为GF3,它能够微弱作用于GF3生成少量的DFA I和蔗糖;此外,该酶为非离子依赖型酶。本文通过计算机模拟方法初步探究SdIFTase结构模型,在此模型基础上通过理性设计和分子改造技术实现SdIFTase的定向进化(包括热稳定性以及酶活的提高),分子改造中涉及的突变分为两类,一类与可能是催化活性中心有关的D183、E194和I80位点,分别突变为D183A、D183N、E194A、E194N、I80A、I80E和I80S。这些突变体和野生酶的酶活有明显差异,表明D183、E194和I80可能处于活性中心。第二类,突变体为可能提高热稳定性的点G281S、G121A/T122L和G236S/G281S/A257S/T313S/A314S。NanoDSC结果显示这些突变体的Tm值明显提高(其中,G121A/T122L提高最明显为4.5°C),表明这些突变体的热稳定性提高。同时,G121A/T122L酶活提高到147.8%。因此,酶活及热稳定性的提高,增加了SdIFTase工业应用的可行性。