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背景:糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病的主要合并症之一,随着糖尿病病程的进展越多患者的视力会因DR受到损伤。视网膜异常新生血管是DR的主要病理特征,新生血管可致网膜反复出血从而加重网膜机化,机化牵拉最终导致视网膜脱离,造成视力丧失。抑制视网膜血管内皮细胞异常的增殖和抗血管生成成为治疗DR的主要的研究方向。miRNA(microRNA)是一类长度在20-24bp的内源性的非编码RNA,可作用于其靶基因信使RNA(mRNA)3’端的非编码区碱基,引起mRNA降解或抑制mRNA翻译,参与到细胞进化、细胞增生、细胞凋亡、肿瘤和免疫反应等生物学过程中。研究发现在DR中多种miRNA异常表达,预计miRNA在DR发病机制中起到重要作用。miRNA在各种癌中有高表达,并且部分miRNA与疾病的纤维化有者密切关系。miRNA与细胞的增殖,凋亡,迁移,成管过程有重要的关系。更重要的是国外有研究报道miR-21在增生性玻璃体视网膜病变患者的玻璃体体液中高表达。然而miR-21对人视网膜微血管内皮细胞新生血管形成的作用及机制尚不明确。本研究采用高糖处理人视网膜微血管内皮细胞(Human Retinal Microvascular Endothelial Cells,HRMECs)模拟PDR的发病过程,结合Real-time PCR、Western blot、免疫荧光、Transwell、流式细胞术等多种生物学技术,探讨mi R-21-5p在PDR中的作用效果及潜在的分子机制。为miR-21将来用于DR的诊断及治疗提供理论基础。目的:明确miR-21-5p在高糖诱导的HRMECs中存在异常表达;明确miR-21-5p沉默对高糖诱导的HRMECs增殖、迁移以及成管的影响;探讨ERK和Akt信号通路参与miR-21-5p对HRMECs的调节过程。为miR-21将来用于DR的诊断及治疗提供理论基础。方法:采用高糖处理HRMECs模拟PDR的发病过程,Real-time PCR、Western blot检测miR-21-5p、VEGF、VEGF-R2的表达,明确高糖对HRMECs的上述指标表达的影响;合成miR-21-5p inhibitor并设置相应阴性对照,转染HRMECs12h后采用高糖诱导,MTT检测HRMECs的增殖,免疫荧光观察Ki67,划痕实验检测HRMECs的迁移能力,用成管实验分析HRMECs的管腔形成能力,Westernblot检测HRMECs迁移相关蛋白MMP-2、MMP-9,血管生成相关蛋白VEGF、HIF-1α及ERK、AKT信号通路相关蛋白及可能性靶基因maspin的表达;加入通路抑制剂LY294002或U0126进行干扰,分析HRMECs迁移以及管腔形成能力,Western blot检测VEGF、HIF-1α、MMP-2、MMP-9的表达。结果:1.MTT检测对照组,高糖组,甘露醇对照组HRMECs24 h、48 h和72 h增殖情况,24h高糖组及48h、72h高糖组HRMECs增殖活性较对照组明显增加,p<0.05,p<0.01。2.Real-time PCR检测对照组,高糖组,甘露醇对照组HRMECs24 h、48 h和72 h细胞VEGF、VEGF-R2、miR-21-5p的表达。24小时高糖组HRMECs的VEGF的表达与对照组,甘露醇对照组明显增加p<0.01,随时间推移48小时高糖组HRMECs及72小时高糖组HRMECsVEGF表达又明显增高p<0.01。24小时高糖组HRMECs的VEGF-R2的表达与对照组,甘露醇对照组明显增加p<0.05,随时间推移48小时高糖组HRMECs及72小时高糖组细胞与对照组,甘露醇比较VEGF-R2表达又明显增高p<0.01。24小时高糖组HRMECs的miR-21-5p的表达与对照组,甘露醇对照组明显增加p<0.05,随时间推移48小时高糖组HRMECs及72小时高糖组HRMECs与对照组,甘露醇对照组比较miR-21-5p表达又明显增高p<0.013.Western blot检测对照组,高糖组,甘露醇对照组各组HRMECs的VEGF、VEGF-R2蛋白的表达。24小时高糖组细胞的VEGF蛋白的表达与对照组,甘露醇对照组明显增加p<0.01。24小时高糖组细胞的VEGF蛋白的表达与对照组,甘露醇对照组明显增加p<0.01,随时间推移48小时高糖组细胞及72小时高糖组细胞VEGF-R2表达与24h高糖组比较又明显增高p<0.01。4.MTT检测对照组、高糖组、高糖+inhibitor NC组、高糖+miR-21-5p inhibitor组各组HRMECs细胞增殖情况。高糖组HRMECs增殖情况比对照组明显增强p<0.01,高糖+miR-21-5p inhibitor组HRMECs增殖活性较高糖+inhibitor NC组及高糖组明显减弱p<0.01。5.免疫荧光观察对照组、高糖组、高糖+inhibitor NC组、高糖+miR-21-5p inhibitor组各组HRMECs增殖标记物Ki67,并对阳性细胞进行计数。高糖组阳性HRMECs比对照组明显增多p<0.01,高糖+miR-21-5p inhibitor组阳性HRMECs较高糖+inhibitor NC组及高糖组阳性HRMECs明显减少p<0.05。6.划痕实验检测对照组、高糖组、高糖+inhibitor NC组、高糖+miR-21-5p inhibitor组各组HRMECs的迁移能力。24 h高糖组HRMECs迁移率比对照组明显增加p<0.01,高糖+miR-21-5p inhibitor组HRMECs迁移率较高糖+inhibitor NC组明显减小p<0.05。7.成管实验检测对照组、高糖组、高糖+inhibitor NC组、高糖+miR-21-5p inhibitor组HRMECs管腔形成能力。高糖组HRMECs交叉点比对照组明显增多p<0.01,高糖+miR-21-5p inhibitor组HRMECs交叉点较高糖+inhibitor NC组及高糖组细胞交叉点明显减少p<0.05。8.Western blot检测高糖处理24 h后对照组、高糖组、高糖+inhibitor NC组、高糖+miR-21-5p inhibitor组细胞MMP-2、MMP-9、VEGF、HIF-1α、maspin、p-AKT、AKT、p-ERK、ERK蛋白的表达。高糖组细胞MMP-2、MMP-9、p-AKT、AKT、p-ERK、ERK蛋白的表达较对照组明显增多p<0.01,高糖+miR-21-5p inhibitor组细胞MMP-2、MMP-9、p-AKT、AKT、p-ERK、ERK蛋白的表达较高糖+inhibitor NC组及高糖组细胞明显减少p<0.01。高糖组细胞VEGF、HIF-1α、maspin蛋白的表达较对照组明显增多p<0.01,高糖+miR-21-5p inhibitor组细胞VEGF、HIF-1α、maspin蛋白的表达较高糖+inhibitor NC组及高糖组细胞明显减少p<0.05。9.划痕实验检测12小时高糖+LY294002组,高糖+U0126组细胞迁移率明显低于高糖组p<0.05,p<0.01。24小时高糖+LY294002组,高糖+U0126组HRMECs迁移率也明显低于高糖组p<0.05。10.成管实验分析高糖+LY294002组,高糖+U0126组细胞交叉点明显低于高糖组p<0.01。11.Western blot检测高糖处理24 h后VEGF、HIF-1α、MMP-2、MMP-9蛋白的表达.高糖+LY294002组,高糖+U0126组细胞VEGF、HIF-1α蛋白的表达明显低于高糖组p<0.01,高糖+LY294002组,高糖+U0126组细胞MMP-2、MMP-9蛋白的表达明显低于高糖组p<0.01。结论:高糖促进HRMECs的增殖活性,上调了miR-21-5p,VEGF和VEGFR2及蛋白在HRMECs中的表达,抑制miR-21-5p能抑制高糖诱导的HRMECs的增殖,抑制miR-21-5p可以抑制高糖诱导的新生血管的生成,miR-21-5p可能通过maspin的靶向调控参与HRMECs血管生成,miR-21-5p影响高糖处理HRMECs的PI3K/AKT和ERK通路活性,PI3K/AKT和ERK通路与高糖诱导HRMECs的血管生成有关,miR-21-5p可能通过调控PI3K/AKT和ERK通路影响HRMECs的血管生成。为miR-21将来用于DR的诊断及治疗提供理论基础。