抑郁症是一种常见的情感性精神障碍综合症,以持续心境低落、行为及认知异常等为主要病症,给社会和家庭均造成了沉重负担。免疫炎症及肠道菌群紊乱在抑郁症发生发展进程中的重要作用日益彰显。甘麦大枣汤(GMZ)是《金匮要略》中的经典名方,由甘草、小麦、大枣三味药组成,三药相合可补心肝脾胃之气,通过调和气血,以达精神治、而悲忧解之功效。现代中药药理学研究提示,GMZ对抑郁情绪的改善作用可能与调节肠道菌群稳态相关。鉴于此方在治疗妇人脏躁等更年期抑郁上具有独特优势,且毒副作用小,在临床应用中常将此方合并经典抗抑郁西药或其他经典名方联合用药,提示GMZ具有一定抗抑郁功效,且与其他治疗方式联合使用,可能发挥更加突出的临床疗效。间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)是机体多能干细胞的一种,具有广泛的免疫调控作用,在中枢神经系统既可参与神经免疫调控也参与神经元分化及神经营养因子分泌,可成为干预抑郁症神经炎症的潜在有效方式。本论文着眼于考察GMZ联合MSC改善抑郁症状的作用并对其作用机制进行初步探讨,为进一步研发抑郁症的新型干预手段提供思路。本论文主要从以下三个方面进行探究:1.GMZ联合MSC对CUMS抑郁症模型的影响小鼠脑立体定位于左右海马部位各注射1×105个MSC,通过活体成像实验观察MSC脑立体定位移植后的存活时间和位置。采用慢性轻度不可预见性(CUMS)刺激建立CUMS抑郁症模型,应用糖水偏好、尾悬实验和敞箱实验的方法进行行为学评价,ELISA方法检测脑内5-HT水平。给予GMZ、MSC及GMZ+MSC联合治疗,考察其对CUMS造模后抑郁样症状的影响,并将总体治疗效果与阳性药氟西汀(Flx)进行对比。同时在此基础上再次将GMZ与Flx联合进行治疗,进一步确证GMZ的抗抑郁效应。结果发现:1)MSC脑立体定位移植至海马区后可以在脑局部存留21天;2)GMZ、MSC及GMZ+MSC联合治疗均可有效缓解小鼠抑郁样症状,主要包括:糖水偏好上升、尾悬实验累计静止不动时间减少、体重增加、摄食量增加、敞箱实验水平及竖直运动次数增加、脑匀浆单胺类递质5-HT水平提高,且GMZ+MSC的抗抑郁效果优于阳性药;3)此外,GMZ+Flx联合治疗也证实GMZ单用及与Flx合用的抗抑郁功效。2.基于肠道菌群稳态探讨GMZ改善抑郁症的作用通过16S rRNA测序对肠道菌群进行检测,并通过群落组成、Alpha多样性、Beta多样性等对数据进行分析。应用粪菌移植模型确认GMZ改善抑郁症的可能机制。最后对肠道菌群调控抑郁样情绪的机制进行初步探索,利用谷氨酸测定试剂盒检测小鼠脑匀浆、血清及肠组织匀浆中谷氨酸水平,GC-MS检测粪便中短链脂肪酸水平、HE染色观察结直肠组织病理变化、Western blot、qRT-PCR及FITC-dextran渗漏实验检测结直肠屏障蛋白、黏液蛋白水平并评估肠道屏障完整性、qRT-PCR检测肠道抗菌肽及炎症水平。结果发现:1)CUMS模型组小鼠肠道菌群存在明显紊乱,与Control组相比,其门水平上的 Firmicutes 和 Bacteroidetes、属水平上的 Barnesiella、Bacteroides 及 Anaerobacterium相对丰度均发生明显改变。PCoA分析发现,两组小鼠肠道菌群物种组成区别明显,ADONIS分析提示其差异具有明显的统计学意义。KEGG分析提示,上述菌群变化可能与包括谷氨酸能突触在内的多种代谢通路有关。相关性分析揭示CUMS模型组小鼠肠道菌群紊乱与其抑郁样情绪显著相关;2)将CUMS模型组小鼠粪菌移植至空白小鼠,发现空白小鼠产生类似CUMS造模后的抑郁样症状,提示菌群紊乱可诱发抑郁样情绪;3)GMZ对CUMS造模引起的小鼠肠道菌群紊乱有一定改善作用,将经过CUMS造模及GMZ治疗后的小鼠粪菌移植至CUMS造模小鼠,发现可缓解后者的抑郁样症状,提示GMZ可能通过调控肠道菌群稳态缓解抑郁症状;4)除了造成肠道菌群紊乱及抑郁样情绪,CUMS造模还可引起小鼠短链脂肪酸水平紊乱、肠道上皮屏障蛋白及粘液蛋白水平下降、肠道屏障功能受损、肠道局部炎症水平轻微提升、中枢谷氨酸水平下降等症状趋势,提示菌-肠-脑轴的调控机制涉及短链脂肪酸水平、肠道屏障完整性、免疫炎症状态、谷氨酸水平等多个方面。3.基于神经免疫炎症探讨MSC改善抑郁症的作用利用ELISA检测MSC对在体CUMS抑郁症模型中枢及外周炎症因子IL-1β、IL-6水平的影响;利用Transwell将MSC与BV2细胞共培养,并通过ELISA、qRT-PCR、免疫荧光、Western blot等手段,检测LPS刺激后BV2细胞中IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎因子及Arg1等抑炎因子水平,从而评价MSC对离体LPS诱导的小胶质细胞炎性激活模型的免疫调控作用。并通过干预TGF-β通路初步探索MSC发挥免疫调控作用的潜在机制。结果发现:1)MSC可有效抑制CUMS抑郁模型中枢IL-1β、IL-6等炎性细胞因子水平;2)对LPS所致BV2小胶质细胞炎性激活,MSC能够在基因及蛋白水平上抑制其IL-1β、IL-6、TNF-α促炎因子水平升高,并提升具有抑炎作用的Arg1基因和蛋白表达水平,发挥免疫调控作用;3)有/无LPS刺激,MSC均可分泌大量TGF-β1和TGF-β2;利用这两种重组蛋白单独或联合作用于LPS激活的BV2细胞,发现TGF-β1重组蛋白可明显提升BV2细胞Arg1基因及蛋白水平的表达,并显著抑制LPS刺激引起的BV2细胞分泌IL-1β水平,提示MSC调控免疫的机制可能与其分泌的TGF-β1有关;此外,不论有无LPS刺激,在MSC条件培养基培养环境中阻断TGF-β信号,均可显著降低BV2细胞中Arg1基因水平,进一步提示MSC通过分泌TGF-β1发挥免疫调控作用。研究结论:1.GMZ联合MSC治疗,对CUMS诱导的小鼠慢性抑郁模型有良好的改善作用,其抗抑郁效果优于Flx。2.CUMS抑郁模型中存在肠道菌群紊乱与情绪异常的相互影响,GMZ可通过调节肠道菌群稳态改善抑郁样情绪。3.MSC可通过调控中枢神经炎症,并促进小胶质细胞转化为Arg1high的抑炎状态,从而改善抑郁样症状。其机制与MSC分泌的TGF-β1水平有关。