论文部分内容阅读
蛋白质酪氨酸的磷酸化和去磷酸化是控制细胞生长、增殖、分化和发育的重要机制,在肿瘤的发生发展中备受关注。蛋白磷酸酶SHP-2作为蛋白酪氨酸磷酸酶家族的一员,参与多种信号通路的调节,尤其在免疫细胞中发挥负调控作用。SHP-2不仅可以负调控Jak-STAT信号通路,还参与T细胞表面抑制性受体PD-1或CTLA-4介导的免疫抑制功能。在肿瘤发生发展过程中,T细胞肿瘤特异性的免疫反应促进了肿瘤细胞的清除,然而PD-1信号却促进肿瘤的免疫逃逸,Jak-STAT3信号在肿瘤进展中也发挥了复杂的作用。因此深入了解肿瘤进展过程中T细胞中SHP-2活性变化及其对肿瘤增殖转移的影响,对于进一步阐明免疫系统在肿瘤进展中的作用以及肿瘤的靶向免疫干预具有重要的意义。在第一章中,我们利用小鼠黑色素瘤细胞B16-BL6足垫移植模型考察了肿瘤进展过程中肿瘤浸润的CD4+T细胞和肿瘤引流淋巴结CD4+T细胞中SHP-2活性变化。胞内染色结果表明,随着肿瘤进展,CD4+T细胞中SHP-2的磷酸化水平逐渐下降。Western blot也支持这一结果,并且显示磷酸化SHP-2的表达下降伴随着STAT3信号通路的激活。此外,随着肿瘤进展血清IL-6水平逐渐增加。以上结果提示磷酸化SHP-2的下调可能促进了IL-6/STAT3信号通路的激活。分析肿瘤微环境和引流淋巴结中各免疫细胞亚群发现,随着肿瘤进展,肿瘤微环境中的CD4+和CD8+T细胞占免疫细胞比例逐渐降低,且细胞表面抑制性受体CTLA-4和PD-1表达逐渐增加。胞内染色结果显示,接种肿瘤5天后,引流淋巴结CD4+T细胞的IFN-y分泌能力与正常小鼠相比增强,但随着肿瘤进展其功能逐渐被抑制。此外,我们还发现随着肿瘤进展,脾脏和肿瘤浸润的免疫细胞中髓系衍生抑制细胞(MDSC)的比例明显提高。在第二章中,我们利用T细胞特异性敲除SHP-2小鼠研究了SHP-2缺失对肿瘤进展和转移的影响。小鼠皮下接种黑色素瘤细胞B16-BL6,结果发现,T细胞SHP-2条件性敲除小鼠与野生型小鼠相比,肿瘤的生长在接种后前两周受到明显抑制。在小鼠黑色素瘤细胞系B16-F10中,我们也发现了同样的现象。然而随着肿瘤进展,SHP-2敲除对肿瘤的生长抑制逐渐被逆转,而且敲除SHP-2并没有改善小鼠存活。分离第十四天时的肿瘤,HE染色、Tunel法及免疫组化结果发现,SHP-2条件性敲除小鼠肿瘤的坏死减轻,凋亡减少,而肿瘤增殖标记物PCNA表达增加。进一步分析肿瘤转移情况发现,SHP-2敲除后,小鼠肺部转移情况明显增加。在B16-F10被动转移模型中,我们也发现SHP-2敲除促进了黑色素瘤的肺转移和肝转移。在第三章中,我们考察了T细胞特异性敲除SHP-2对荷瘤小鼠细胞因子及免疫细胞各亚群数量及功能的影响。检测小鼠血清和分离肿瘤组织培养上清发现,T细胞特异性敲除SHP-2后,JL-6、TNF-α等细胞因子均明显增加。进一步分析发现,肿瘤组织培养上清中的IL-6等细胞因子主要由CD45.2+的免疫细胞分泌。说明SHP-2敲除后,免疫细胞中的IL-6信号通路被激活。免疫组化检测肿瘤组织磷酸化STAT3发现,SHP-2敲除后STAT3的磷酸化水平明显增加。以上结果提示免疫细胞分泌的IL-6很可能以旁分泌的形式激活了肿瘤STAT3活性。分析免疫细胞各亚群比例发现,T细胞中敲除SHP-2不影响CD4+T、CD8+T细胞以及肿瘤相关巨噬细胞的比例及功能,但显著促进MDSC在肿瘤和脾脏部位的积累。在B16-F10被动转移模型中,SHP-2敲除小鼠肺转移灶和脾脏中的MDSC比例也显著增加。进一步分析MDSC功能发现,SHP-2敲除小鼠MDSC中的Arg-1等功能相关分子表达增加。在第四章中,我们研究了IL-6和MDSC在黑色素瘤进展中的作用。MDSC-B16BL6混合接种实验发现同对照小鼠的MDSC相比,SHP-2条件性敲除小鼠的MDSC明显促进了黑色素瘤的生长。表明T细胞中SHP-2敲除增强了MDSC的促肿瘤作用。进一步通过IL-6抗体中和实验,我们发现中和IL-6后,SHP-2条件性敲除小鼠脾脏部位的MDSC比例明显下降,黑色素瘤的生长也受到明显抑制。这些结果提示,SHP-2敲除后,IL-6的大量表达可能促进了MDSC的积累,从而促进肿瘤转移。综上所述,本论文首先发现黑色素瘤进展过程中CD4+T细胞中磷酸化SHP-2表达是逐渐下降的。接下来利用SHP-2条件性敲除小鼠,我们发现T细胞中特异性敲除SHP-2促进了IL-6、TNF-α等炎症因子的分泌。虽然IL-6等炎症因子在早期可以抑制黑色素瘤的生长,但随着肿瘤进展,IL-6促进了MDSC分化及其在肿瘤部位的积累,反过来促进了肿瘤生长和转移。本论文借助T细胞SHP-2条件性敲除小鼠首次揭示T细胞蛋白磷酸酶SHP-2在肿瘤进展和转移中发挥重要作用,表明SHP-2是一个关键抑癌分子,可以通过负调控作用抑制肿瘤转移。同时也暗示免疫细胞中SHP-2缺失会导致炎症因子大量分泌,促使肿瘤免疫由抗肿瘤向促肿瘤转变。