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实验背景和目的： 全氟辛烷磺酸（PFOS）是一种人造化学品并且具有多氟基团。与其他表面活性剂相比，全氟辛烷磺酸的高热稳定性和化学耐久性使其具有无与伦比的性能和应用。因此，全氟辛烷磺酸作为反应添加剂被广泛用于工业用品。近年来国内外学者研究发现，全氟辛烷磺酸具有发育毒性并且介导雄性生殖毒性，延缓男性性发育。青春期性发育主要依赖青春期的睾丸间质细胞分化。大鼠睾丸间质细胞在出生后第 21 天分化为祖睾丸间质细胞，第 35 天分化为幼睾丸间质细胞，第56 天分化为发育良好的成年睾丸间质细胞并产生足够的睾酮，大鼠青春期性发育从第35天开始进行。然而，全氟辛烷磺酸是否影响青春期性发育及其潜在的机制尚不清楚。本项目研究低剂量全氟辛烷磺酸青春期染毒对大鼠睾丸间质细胞发育的影响。 实验方法： 体内实验，随机选取15只35日龄的雄性Sprague Dawley大鼠（SD大鼠）进行全氟辛烷磺酸灌胃处理，灌胃剂量范围设定为 0、5 或 10 mg/kg，连续21天。收集大鼠血液，化学发光法检测分析睾酮（T）水平，ELISA法检测促黄体生成素（LH）和卵泡刺激素（FSH）水平；切除并称重双侧附睾然后进行精子计数；每对睾丸分离并称重，一侧固定在Bouins溶液中用于免疫组织化学[以所有睾丸间质细胞标记物胆固醇侧链裂解酶（CYP11A1）和后期发育阶段的睾丸间质细胞标记物11β-羟基类固醇脱氢酶1（HSD11B1）]分析睾丸间质细胞数目。对侧睾丸冷冻在液氮中以提取 RNA 用实时定量 PCR（qPCR）分析睾丸间质细胞和支持细胞相关基因，以制备匀浆提取蛋白用Western blot（WB）分析其相关蛋白质表达水平，并在睾丸匀浆中离体采用同位素标记和薄层层析-同位素扫描法检测HSD3B1、CYP17A1和HSD17B3的酶活性。 体外研究，随机选择18只35日龄的雄性Sprague Dawley大鼠（SD大鼠）采用 Percoll 梯度离心法分离纯化幼睾丸间质细胞，共制备三批。将幼睾丸间质细胞分离到6孔板，并按照0、50、500和5000 nM浓度梯度的全氟辛烷磺酸培养 24 小时后，收集培养基用于按放射免疫分析法检测睾酮（T）和 5α-雄二醇（DIOL）浓度水平，收集细胞用于 qPCR 测定睾丸间质细胞相关基因（Lhcgr、Scarb1、Star、Cyp11a1、Hsd3b1、Cyp17a1、Hsd17b3、Nr5a1 和 Pcna）和 WB测量相关蛋白（LHCGR、SCARB1、CYP11A1、HSD3B1、CYP17A1、HSD17B3和NR5A1）的表达水平。另外，将幼睾丸间质细胞分离到12孔板，并按照0和5000 nM浓度梯度的全氟辛烷磺酸培养24小时后收集细胞，以备评估睾丸间质细胞的早期和晚期凋亡活性，这一步通过采用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒来完成，收集细胞用于WB检测凋亡蛋白BAX和抗凋亡蛋白BCL-2的表达水平。 实验结果： 体内实验发现，10 mg/kg剂量组大鼠体重和睾丸重量显著降低，附睾重量在5和10 mg/kg剂量组均显著降低，表明全氟辛烷磺酸可能是一种抗雄激素物质。同时，暴露组大鼠的血清睾酮水平及附睾精子数均显著降低，说明全氟辛烷磺酸抑制雄激素的产生并阻断精子发生。免疫组织化学结果显示，全氟辛烷磺酸不影响暴露组的睾丸间质细胞数，表明全氟辛烷磺酸不影响睾丸间质细胞增生。qPCR和WB结果显示全氟辛烷磺酸显著下调Lhcgr、Cyp11a1和Cyp17a1的mRNA和蛋白水平，体外检测酶活性结果证实全氟辛烷磺酸显著抑制 CYP17A1 的活性，而不影响HSD3B1和HSD17B3。体内数据表明，全氟辛烷磺酸通过下调几种关键的睾丸间质细胞特异性基因的表达从而延缓睾丸间质细胞分化。体外实验发现，大于等于50 nM浓度的全氟辛烷磺酸显著降低睾酮（T）、5α-雄二醇（DIOL）和总雄激素（T+DIOL）水平，表明全氟辛烷磺酸是大鼠幼睾丸间质细胞类固醇生成的强力抑制剂。低至50 nM的全氟辛烷磺酸显著下调HSD17B3的mRNA和蛋白水平，大于等于500 nM的全氟辛烷磺酸降低了LHCGR蛋白水平并且5000 nM 的全氟辛烷磺酸也降低了 CYP17A1 蛋白水平，基因的表达水平与蛋白表达一致。此外，全氟辛烷磺酸并没有改变Pcna基因的表达水平，说明体外条件下全氟辛烷磺酸抑制睾丸间质细胞分化，而不影响睾丸间质细胞增生。应用Annexin V-FITC/PI 检测对幼睾丸间质细胞的凋亡活性进行分析发现，全氟辛烷磺酸在5000 nM时显著增加细胞凋亡比例，大于等于500 nM的全氟辛烷磺酸显著下调BCL-2水平并上调BAX水平，说明BCL-2/BAX信号通路可能与全氟辛烷磺酸诱导细胞凋亡有关。 实验结论： 在青春期，全氟辛烷磺酸低剂量暴露可以显著延缓大鼠睾丸间质细胞的发育。这种作用很可能与全氟辛烷磺酸破坏了睾丸间质细胞特异性基因的表达有关。