动脉粥样硬化是与多种危险因素相关的的动脉慢性炎症性疾病。其早期的重要病理改变之一是单核细胞在血管内皮细胞功能受损时迁移到内皮下,分化为巨噬细胞,并且摄取大量脂质转变为泡沫细胞,泡沫细胞在血管壁内是动脉粥样硬化早期形成脂质条纹的主要原因。泡沫细胞内脂滴存在的主要脂质是胆固醇酯,它是胆固醇的储存形式,在脂酰CoAN固醇酯酰转移酶(ACAT)催化下而产生。当细胞内胆固醇达到一定量时,ACAT将其酯化储存于细胞内,以避免高浓度的胆固醇对细胞产生毒性作用。但在病理条件下,ACAT活性异常升高,使巨噬细胞摄取脂质过多促使胆固醇酯大量堆积,对动脉粥样硬化病变早期泡沫细胞的形成起到关键作用。ACAT有两种亚型——ACAT-1和ACAT-2,ACAT-1在单核巨噬细胞中是主要的异构酶。研究表明,泡沫细胞形成过程中ACAT-1活性明显上调。但是迄今为止,导致ACAT活性上调的机制还不十分清楚,有待于进一步的研究。瘦素是一种由脂肪细胞分泌的激素,其主要功能为,通过与下丘脑部位的相应受体结合,对机体的食物摄入、能量消耗、脂肪储存进行中枢性调节。瘦素在外周调节中同样起着重要作用,它可以直接调节免疫细胞、胰腺B细胞、脂肪细胞和肌细胞。近年来的临床流行病学研究认为,高瘦素血症是动脉粥样硬化的主要危险因素之一,瘦素是通过与其受体结合来传递调节能量代谢信号的,人类的瘦素受体OB-R有5种异形体(isoform),其中OB-Rb是唯一能进行信号转导并调节能量代谢的异形体。JAK-STAT途径目前被认为是瘦素信号转导的主要途径。瘦素除通过上述途径转导信息外,还可通过活化的Ras蛋白作用于多种靶蛋白,其中最重要的一种是Raf激酶,。这一信号转导途径称为Ras-Raf-MEK-MAPK途径,是瘦素信号转导的另一途径。目前,有研究证明在高瘦素血症情况下,胆固醇酯的合成增加,这种增加被证明是因为瘦素上调单核细胞向泡沫细胞分化过程中的ACAT-1活性所致。但这种上调是否有剂量和时间依赖效应还未见报道,此外瘦素对ACAT-1的调节是通过一个什么样的信号转导途径,也尚无相关研究。综上所述,本课题拟采用细胞培养及分子生物学技术进行以下研究:①单核细胞向泡沫细胞诱导分化过程中ACAT-1的表达及活性的变化。②瘦素对单核细胞向泡沫细胞分化过程中ACAT-1表达及其活性的影响如何,是否存在剂量或时间依赖效应。③瘦素对单核细胞向泡沫细胞分化过程中ACAT-1表达及其活性的影响是通过什么样的信号转导通路。第一部分单核细胞向泡沫细胞诱导分化过程中ACAT-1表达及其活性的变化目的:研究单核细胞向泡沫细胞诱导分化过程中ACAT-1表达及活性的变化。方法:1.复苏、培养人单核细胞株THP-1细胞;2.单核细胞株THP-1细胞与乙酸肉豆蔻佛波酯(PMA)共孵育1-4天、倒置显微镜下观察细胞形态学变化,流式细胞术检测诱导后CD14的表达,RT-PCR方法检测单核细胞分化过程中ACAT-1 mRNA表达,Western blotting检测ACAT-1蛋白表达的变化,液相闪烁计数法检测ACAT-1酶活性。3.巨噬细胞与氧化低密度脂蛋白共孵育1-4天,倒置显微镜下观察细胞形态学变化,油红O染色观察细胞质内脂质沉积,RT-PCR方法检测巨噬细胞分化过程中ACAT-1 mRNA的表达,Western blotting检测ACAT-1蛋白表达的变化,液相闪烁计数法检测ACAT-1酶活性。结果1.单核细胞株THP-1细胞复苏后呈悬浮生长、增殖,加入PMA诱导48小时后,细胞形态由圆形变成椭圆形或者不规则形态,为贴壁生长形式,体积明显增大、细胞浆疏松化明显,细胞器增多、细胞膜周围可见突起及伪足形成。PMA诱导后,单核细胞株THP-1细胞可表达CD14,阳性率为85.7%,表明单核细胞分化成为巨噬细胞。2.巨噬细胞经ox-LDL诱导24小时后细胞体积进一步增大,为贴壁生长形式,胞浆疏松。油红O染色胞质内可见红染物质,表明巨噬细胞分化成为泡沫细胞。3.在PMA诱导单核细胞株THP-1向巨噬细胞分化过程中,ACAT-1mRNA、蛋白表达及酶活性水平明显增高(P＜0.05),呈时间依赖效应,在培养3天后达到最高水平。。4.在ox-LDL诱导巨噬细胞向泡沫细胞分化过程中,ACAT-1mRNA、蛋白表达及酶活性水平增高,呈时间依赖效应,在培养2天后达到最高水平。但和无血清培养巨噬细胞对照组比较无显著性差异(P＞0.05)。结论1.单核细胞株THP-1经PMA和ox-LDL诱导后,可分化为巨噬细胞、泡沫细胞。2.ACAT-1的表达及活性增高在单核细胞向泡沫细胞诱导分化过程中起着重要作用。第二部分瘦素(Leptin)对单核细胞株THP-1向泡沫细胞诱导分化过程中ACAT-1表达及活性的影响目的:研究瘦素对单核细胞向泡沫细胞诱导分化过程中ACAT-1表达及其活性的影响。方法:1.复苏、培养人单核细胞株THP-1细胞2.单核细胞向泡沫细胞诱导分化过程中,分别加入不同浓度的瘦素,MTT法测定细胞的存活率,选择对细胞生长无显著影响的浓度梯度。3.单核细胞在PMA诱导下向巨噬细胞分化过程中分别加入1mmol/L、2.5mmol/L、5mmol/L、10mmol/L和15mmol/L的瘦素共培养1-4天,观察瘦素对ACAT-1表达和活性影响的时间、剂量效应。然后观察这种影响能否被抗瘦素抗体所拮抗。RT-PCR方法检测细胞ACAT-1 mRNA表达,Western blotting检测细胞ACAT-1蛋白水平,液相闪烁计数法检测细胞ACAT-1酶活性;4.巨噬细胞在ox-LDL诱导下向泡沫细胞分化过程中分别加入1mmol/L、2.5mmol/L、5mmol/L、10mmol/L和15mmol/L的瘦素共培养1-4天,观察瘦素对ACAT-1表达和活性影响的时间、剂量效应。然后观察这种影响能否被抗瘦素抗体所拮抗。RT-PCR方法检测细胞ACAT-1 mRNA表达,Western blotting检测细胞ACAT-1蛋白表达水平,液相闪烁计数法检测细胞ACAT-1酶活性;结果1.15mmol/L以下浓度梯度的瘦素与细胞共培养时对细胞的生长无明显影响,20mmol/L瘦素组细胞存活率低于50%。2.在单核细胞向巨噬细胞的诱导分化过程中,用不同浓度的瘦素干预后ACAT-1 mRNA、蛋白的表达水平及酶活性增加,呈剂量依赖和时间依赖效应,当瘦素为10mmol/L培养时间达3天时上调作用最明显,ACAT-1的表达水平约为对照组的2倍。该上调作用能被抗瘦素抗体完全拮抗。3.在巨噬细胞向泡沫细胞的诱导分化过程中,用不同浓度的Leptin干预后细胞中ACAT-1 mRNA、蛋白的表达水平及酶活性增加,呈剂量依赖和时间依赖效应,当Leptin为10mmol/L培养时间达2天时上调作用最明显,ACAT-1的表达水平约为对照组的1.5倍。该上调作用能被抗瘦素抗体完全拮抗。结论1.瘦素可以上调单核细胞向巨噬细胞、巨噬细胞向泡沫细胞诱导分化过程中ACAT-1的活性。并呈时间、剂量依赖效应2.瘦素对单核细胞向泡沫细胞诱导分化过程中ACAT-1活性的影响是通过上调其转录和转录后蛋白表达水平而实现的。第三部分瘦素影响单核细胞向泡沫细胞诱导分化过程中ACAT-1表达的信号转导机制研究目的研究瘦素上调单核细胞向泡沫细胞诱导分化过程中ACAT-1表达的信号转导机制。方法复苏、培养人单核细胞株THP-1细胞,并分别向巨噬细胞、泡沫细胞方向诱导分化。1.在单核细胞诱导分化为巨噬细胞和巨噬细胞分化为泡沫细胞后,分别测定细胞中瘦素受体OB-Rb的蛋白表达水平。2.在单核细胞与PMA、瘦素共培养的基础上,分别加入Raf抑制剂、JAK激酶抑制剂、STAT3抑制剂、MAPK抑制剂干预,观察各抑制剂对瘦素上调ACAT-1表达水平的影响。RT-PCR方法检测细胞ACAT-1 mRNA表达,Western blotting检测细胞ACAT-1蛋白水平,液相闪烁计数法检测细胞ACAT-1酶活性。3.在巨噬细胞与ox-LDL、瘦素共培养基础上,分别加入Raf抑制剂、JAK激酶抑制剂、STAT3抑制剂、MAPK抑制剂干预,观察各抑制剂对瘦素上调细胞ACAT-1表达水平的影响。RT-PCR方法检测细胞ACAT-1 mRNA表达,Western blotting检测细胞ACAT-1蛋白水平,液相闪烁计数法检测细胞ACAT-1酶活性。结果1.在瘦素干预下单核细胞向巨噬细胞、泡沫细胞诱导分化过程中,瘦素受体OB-Rb表达增高,与单核细胞比较有显著性差异(P＜0.05),但巨噬细胞和泡沫细胞之间无显著性差异(P＞0.05)。2.在单核细胞向巨噬细胞分化过程中,瘦素对ACAT-1表达的上调作用可以分别被JAK激酶抑制剂、STAT3抑制剂大部阻断;Raf抑制剂、MAPK抑制剂部分阻断。3.在巨噬细胞向泡沫细胞分化过程中,瘦素对ACAT-1表达的上调作用可以分别被JAK激酶抑制剂、STAT3抑制剂大部阻断;Raf抑制剂、MAPK抑制剂部分阻断。结论瘦素在单核细胞向泡沫细胞分化过程中,对ACAT-1表达水平的上调作用可能通过两条信号转导通路,即瘦素受体OB-Rb--JAK激酶--STAT3和瘦素受体OB-Rb -Raf-MAPK通路,而瘦素受体OB-Rb--JAK激酶--STAT3是主要的信号转导通路。