【摘 要】
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为今后高效表达TNF、IFN等具有抗肿瘤作用药物打下基础, 对扣囊复膜孢酵母（Sacchromycopsis fibuligera） (-葡萄糖苷酶(（-glucosidase）基因 （BGL1）进行了克隆，并在巴斯德毕赤酵母（pichia pastoris）中加以表达。根据扣囊复膜孢酵母(-葡萄糖苷酶基因 （BGL1）序列和巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K多克隆位点（multiple clon
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为今后高效表达TNF、IFN等具有抗肿瘤作用药物打下基础, 对扣囊复膜孢酵母（Sacchromycopsis fibuligera） (-葡萄糖苷酶(（-glucosidase）基因 （BGL1）进行了克隆，并在巴斯德毕赤酵母（pichia pastoris）中加以表达。根据扣囊复膜孢酵母(-葡萄糖苷酶基因 （BGL1）序列和巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K多克隆位点（multiple cloning site）序列，设计两对PCR引物。将以SHF和SHR为引物的PCR产物连接到pGEM-T载体上，构建pSHLTV。用限制性内切酶切下目的基因，插入到巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K中，使之位于(-因子信号肽下游，且与共享同一开放阅读框（ORF,open reading frame）, 构建重组质粒pSHL9K。 通过电转化将重组质粒pSHL9K转入Pichia pastoris GS115菌株中，整合到染色体后，获得稳定高效表达BGL1基因的重组Pichia pastoris菌株，经过G418抗性筛选，得到含目的基因拷贝数最多的重组菌株。重组酶的最适作用温度为50℃，最适pH为5.4。通过表达条件的优化，培养液中总蛋白含量可达9 g/L以上，培养液中(-葡萄糖苷酶活性为47 IU/mL，SDS-PAGE测定目的蛋白相对分子量约为113 kDa。(-葡萄糖苷酶能够分解纤维二糖，葡萄糖苷-N-脂酰鞘氨醇, 葡萄糖亚麻苦苷等(-葡萄糖苷。人体缺乏(-葡萄糖苷酶会导致葡萄糖苷-N-脂酰鞘氨醇的积累，引起戈谢病（Gaucher disease）。(-葡萄糖苷酶可用于肿瘤的诊断和治疗。毕赤酵母能够高效表达TNF、IFN等具有抗肿瘤作用的细胞因子，本实验加深了对这种表达系统的研究，有助于表达更多的抗肿瘤药物。本研究首次将扣囊复膜孢酵母(-葡萄糖苷酶基因在巴斯德毕赤酵母中进行表达，并且实验证明已得到稳定高效表达BGL1基因的重组Pichia pastoris菌株。
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