细胞自噬是真核生物中一种保守的细胞内物质降解途径,它通过降解细胞内错误折叠的蛋白和受损的细胞器等,实现物质的循环,从而帮助细胞维持稳态。在高等真核生物中,细胞自噬还与多种生理和病理过程相关,如生长发育、免疫反应、程序性细胞死亡、肿瘤和神经退行性病变等。细胞自噬过程中,自噬前体膜不断延伸并包裹部分细胞组分,最终形成具有双层膜的自噬体并与溶酶体(植物和酵母中为液泡)融合而被降解。这一过程受到众多自噬相关蛋白Atg的调控,但细胞自噬过程本身也是一个膜泡(膜和囊泡)运输过程,最近已不断有文献报道调控囊泡运输的Rab/Ypt蛋白及SNARE蛋白也参与细胞自噬。例如,酵母中的Rabl/Yptl通过不同的模块分别调控内质网到高尔基体的囊泡运输和细胞自噬过程的起始,Rab7/Ypt7则通过相同的模块调控晚期内体和自噬体与液泡的融合过程。本论文重点探讨内吞途径中作用于Ypt7之前的Rab5及其上下游蛋白突变对细胞自噬的影响及参与的机制,得到如下几方面主要结果：1.Vps21缺失导致自噬体成簇堆积在液泡外酿酒酵母有三个Rab5同源蛋白Vps21、Ypt52和Ypt53,其中Vps21、在囊泡运输中起主要作用。本论文首先检测了这三个蛋白缺失对细胞自噬的影响。结果显示,Vps21缺失菌株中碱性磷酸酶活性降低、Ape1成熟受阻和GFP-Atg8降解受阻,而Ypt52和Ypt53缺失不产生类似的自噬缺陷表型,但Ypt52与Vps21同时缺失时,自噬缺陷增强。荧光显微镜观察GFP-Atg8的定位发现,在Vps21缺失菌株中,约半数细胞中GFP-Atg8标记的点状结构随着自噬的进行不断聚集在液泡膜边沿堆积成新月状结构,且这一表型的产生依赖于自噬关键蛋白Atg1,而Ypt52和Ypt53缺失菌株中GFP-Atg8则与野生型一样位于液泡内。透射电镜分析发现,Vps21缺失菌株中堆积的新月状结构为成簇的自噬体。这说明,Vps21缺失导致自噬过程中产生的自噬体聚集于液泡边沿而无法进入液泡被降解。2.Vps9缺失产生与Vps21缺失类似的自噬缺陷且可通过过量表达Vps21进行抑制Rab蛋白要行使功能,需要在鸟苷酸交换因子(GEF)的作用下,由GDP结合的非活性状态转变为GTP结合的活性状态。本研究发现,Vps21的GEF蛋白Vps9缺失产生与Vps21缺失类似的自噬缺陷袁型：碱性磷酸酶活性降低、Apel成熟和GFP-Atg8降解受阻及自噬体成簇堆积在液泡外等。而且,vps9△菌株中的自噬缺陷可以通过过量表达野生型和GTP结合形态的Vps21得到抑制。新鉴定的Vps21的另一个GEF蛋白Muk1缺失不影响细胞自噬,但与Vps9同时缺失时,自噬缺陷显著增强,且不能通过过量表达Vps21得到抑制。这说明,在细胞自噬途径中,Vps21和Vps9依然以Rab-GEF的关系发挥作用,而Mukl可能以其他的间接方式如通过稳定Vps21的活性形态或激活其他Rab蛋白发挥作用。3.Vps21下游效应物缺失产生与Vps21缺失相似的自噬缺陷Rab蛋白Vps21、上游GEF蛋白Vps9和下游相应的效应蛋白共同构成了Vps21的作用模块;Rab蛋白Ypt7、上游GEF复合体Monl-Cczl和下游效应蛋白共同构成了Ypt7的作用模块,调控内体和自噬体与液泡的融合。内吞途径中,Vps21下游的效应物(蛋白和蛋白复合体)有：栓系因子CORVET复合体、连接蛋白Vac1、t-SNARE蛋白Pep12和SM家族蛋白Vps45。本研究显示,Vps3和Vps8 (CORVET的特有亚基)、Vac1、Pep12和Vps45缺失产生与Vps21缺失相似的自噬缺陷表型,突变体中Apel的成熟和GFP-Atg8的降解受阻,且GFP-Atg8在液泡膜边沿堆积成新月状结构,但不同突变体中表型强弱存在差异。其中,vaclΔ、vps3Δ和pepl2Δ菌株中自噬缺陷表型最强。此外,Vps21模块蛋白缺失产生的自噬缺陷表型不同与Ypt7模块蛋白缺失产生的自噬缺陷表型,后者的自噬体散乱分布于细胞质中。这些结果说明,不只是Vps21和Vps9,而是整个Vps21模块都参与细胞自噬。4.Vps21下游效应蛋白缺失菌株中Vps21在PAS的定位增加Vps21通过定位到内体而参与内吞运输,也可能通过定位到自噬体形成的起点PAS而参与细胞自噬。Vps21若定位到PAS位点,可作为其直接参与细胞自噬的证据之一。本研究发现,野生型中Vps21与PAS标志蛋白Ape1和Atg8均有共定位,但比例较低,这可能由于自噬体形成速度很快而Vps21在PAS的定位是瞬时的。与这一推测一致的是,Vps21下游SNARE蛋白Pep12缺失导致Vps21调节的步骤受阻,Vps21本身和自噬体均发生堆积,在pep12Δ菌株中,Vps21与这两个蛋白的共定位均显著增加。这些结果表明,Vps21定位到PAS位点,可能因而参与细胞自噬。5.Vps21模块可能通过P13K复合体参与细胞自噬为了探讨Vps21模块参与细胞自噬的可能机制,本研究通过酵母双杂交检测了Vps21模块蛋白与自噬相关蛋白之间的互作情况。结果显示,Vps21模块中的蛋白都与Atg17、Atg20和Atg24中的一个或几个有不同程度的互作,其中,Vps8与这三个自噬蛋白均有互作且互作最强,推测Vps21模块蛋白可能通过与Atg17支架系统(Atg17、Atg20和Atg24)的互作被招募到自噬体上,从而参与细胞自噬。Vps34是磷脂酰肌醇3-激酶(P13K)复合体的催化亚基,在内吞途径和细胞自噬途径中都有很重要的作用。酵母双杂交筛选发现,Vps8与Vps34有互作。进一步检测Vps21模块与P13K激酶复合体亚基的互作发现,Vps8与PBK复合体的亚基Vps34、 Vpsl5和Vps30均有互作(与Vps15互作最强),而Vps21也与Vps15有互作,且Vps8与Vps34的互作依赖于与Vps21和Pep12,而不依赖于Ypt7及其下游t-SNARE蛋白Vam3,说明Vps21模块作为一个整体与P13K复合体相互作用。Vps21模块还参与调控Vps34的定位,Vps21模块蛋白缺失使Vps34不能正确定位到PAS位点。本研究进一步深入分析发现,Vps8不同结构域缺失对Vps8与Vps34互作、Vps34的定位和自噬过程的影响不同。总体上来说,Vps8的N端结构域对Vps8与Vps34的互作很重要,也是Vps8与Vps21互作所必需的,但Vps8的C端结构域对Vps34的定位和自噬功能更重要。根据这些结果推测Vps21模块可能通过调控Vps34的定位而参与细胞自噬。6.Vps21模块参与自噬体的封口过程蛋白酶保护实验可用于检测某一突变体中的自噬体膜是否已封口。通过这一方法,本研究发现Vps21模块蛋白缺失菌株中堆积的自噬体未封口,不同于Ypt7模块蛋白缺失菌株中已封口的自噬体,且与在内吞途径中的关系类似,Vps21模块在自噬途径中也作用于Ypt7模块之前。结合电镜所观察到的vps21Δ菌株中成簇堆积的自噬体状结构,推断Vps21模块参与自噬体的封口过程。以上内容探讨了酿酒酵母Rab蛋白Vps21及其上下游蛋白在细胞自噬中功能,揭示调控内吞途径的Vps21模块也参与细胞自噬途径。进一步研究发现,Vps21模块可能通过P13K复合体参与细胞自噬。另外,Vps21模块作用于自噬体的封口过程且作用于Ypt7之前。本研究结果为进一步深入研究Vps21模块参与细胞自噬的机制打下基础,也为研究其他Rab蛋白参与细胞自噬的机制提供参考。