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第一部分玫瑰树碱抑制人类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞生长致使其凋亡 目的：5,11-二甲基-6H-吡啶并[4,3-B]咔唑从乔木椭圆玫瑰树中提取的生物碱，具有抗炎和抗肿瘤的作用。本部分重点研究玫瑰树碱对人类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞（Rheumatoidarthritis fibroblast-like synoviocytes, RA-FLSs）增殖以及凋亡的影响。为玫瑰树碱治疗RA提供相关的理论依据。 方法：1.新鲜的5例RA滑膜组织取材于苏州州大学附属常州第四人民医院骨科因RA行全膝关节置换术的患者。RA的诊断标准符合美国风湿病学协会（ACR）修订的诊断标准。手术中得到的滑膜组织剪成很碎的小块之后，用胶原酶消化，得到细胞悬液进行培养。用光学显微镜（Light microscope）观察细胞的形态，流式细胞术（ Flowcytometry, FCM）分析体外培养的RAFLSs表面标记的白细胞分化抗原3（Clusterof differentiation3，CD3）、CD19、CD14、以及CD90的表达情况。 2.RA-FLSs在小牛血清中培养，标准情况下细胞饥饿培养12小时，分别加入纯度大于98%玫瑰树碱0.5，1,2,4,8μM,溶解于0.1%的二甲基亚砜（DMSO）中，细胞活力检测用 MTT法3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide溶液0.5mg/ml加入细胞培养，在37°培养4小时，DMSO去溶解细胞，用570nm吸光度进行检测，测的玫瑰树碱的最大半数抑制量IC50.Brdu检测。细胞用玫瑰树碱处理后48小10μM的Brdu加入溶液4小时，发色底物四甲基联苯胺（chromogenic substrate tetramethylbenzidine）检测吸光度为450nm波长。 4.流式细胞仪检测细胞凋亡用Annexin V-FITC/PI对 RA-FLSs细胞凋亡进行检测。 5.凋亡相关蛋白半胱氨酸天冬氨酸酶-3(Caspase-3;激活型)和Caspase-3的活力检测用(BioVision, Mountain View, CA)公司的比色测定试剂盒检测，检测吸光度为450nm波长 结果1.用流式细胞仪检测 RAFLSs细胞的纯度(CD90+>95％， CDl4+<2％， CD3+<1％，andCDl9+<1％) 2.玫瑰树碱减少细胞的活力用玫瑰树碱处理后的24到72小时后MTT分析，用到4-8μM时细胞各自减少32%和45%，48小时后IC50为2.1±0.3μM，72 h后为1.6±0.2μM。相比正常人的滑膜成纤维细胞，经玫瑰树碱加入量增加到8μM不影响细胞的活力，说明玫瑰树碱选择性作用于RA-FLSs。 3.BrdU掺入法检测经玫瑰树碱处理48小时后的RA-FLSs，明显可见BrdU掺入整合到细胞中的量减少，4μM玫瑰树碱减少58%，相对于空白对照有统计意义(p<0.05)。 4.4.Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测caspase-3活力增加40-90%，相对于空白对照有统计意义(p<0.05)。 结论： 1.从类风湿关节炎病人提取RA-FLSs能符合后面实验的研究 2.玫瑰树碱能够显著的抑制RA-FLSs的细胞增殖能力。 3.玫瑰树碱处理细胞能诱导RA-FLSs细胞凋亡. 第二部分经STAT3途径玫瑰树碱促使人类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡 目的： STAT3是细胞信号转录转导因子，在细胞凋亡过程中起着重要的作用。本部分重点研究STAT3在玫瑰树碱诱导的RAFLS细胞凋亡过程中的作用，为理解玫瑰树碱诱导RAFLS细胞凋亡的机制提供理论依据。 方法用不同浓度的玫瑰树碱(i.e.0.5,1,2,4 and8μM)加入RA-FLSs中，24–72小时后测量其活力情况：包括增殖以及凋亡情况。Western blot对STAT3及其下游蛋白的检测。用STAT3质粒Lipofectamine2000转染RA-FLS细胞12小时，然后加入玫瑰树碱1或4μM，用萤火虫和海肾荧光素酶双检测以及对其进行补救实验。连续变量用均数±标准差(SD)表示，所有的统计资料均采用SPSS18进行统计学分析。多个样本均数的比较以及组间比较采用单因素方差分析(One-way analysis of variance)。分类变量以及样本率的比较采用Tukeypost-hoc检验。P<0．05认为有统计学意义。 结果，玫瑰树碱抑制滑膜风湿细胞的活力及增殖，这种抑制是依靠浓度的增加而更有效。作为对照，玫瑰树碱对正常人的滑膜细胞不起作用。实验中发现玫瑰树碱促使RA-FLSs凋亡伴随着caspase-3活力的增加，从其作用的机制分析是玫瑰树碱抑制了STAT3的磷酸化降低的其下游基因Mcl-1, cyclin D1 and Bcl-2的表达，双荧光素酶报告基因检测显示玫瑰树碱对STAT3对RA-FLSs转录转导活性的抑制。组成型活性的STAT3的过度表达扭转了玫瑰树碱对RA-FLSs,的抑制，表现在恢复了Mcl-1, cyclin D1 and Bcl-2的表达。 结论：玫瑰树碱可促进RAFLSs中STAT3蛋白的磷酸化； 靶向抑制内源性总STAT3蛋白表达可抑制玫瑰树碱诱导的促RAFLS凋亡的作用。结果提示，玫瑰树碱介导的促RA-FLS凋亡的作用可能与玫瑰树碱促进STAT3蛋白磷酸化有关。