绍兴黄酒生麦曲的微生物群落演替驱动力研究与制曲工艺优化

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生麦曲作为黄酒发酵的主要发酵剂之一,是黄酒酿造双边发酵工艺的重要原料。生麦曲(块曲)是以小麦为原料经固态堆曲发酵而成,其特殊的块状结构与丁字形摆放方式使得发酵过程中理化因子(温度、水分、含氧量等)的变化时刻影响着麦曲的微生物群落演替。目前关于黄酒生麦曲微生物群落结构演替及其与环境因子动态变化的相关性研究较少,严重制约了生麦曲现代化生产的发展,解析黄酒生麦曲群落结构演替的驱动力对于促进黄酒生麦曲现代化与黄酒品质提升具有重要意义。本论文的主要结论如下:(1)手工生麦曲的群落结构演替规律分析。手工生麦曲中共检测到1435个细菌属与257个真菌属,其中芽孢杆菌(Bacillus)、泛菌(Pantoea)、糖多孢菌(Saccharopolyspora)、葡萄球菌(Staphylococcus)与魏斯氏菌(Weissella)是手工曲的主要细菌属(相对丰度和>88.2%),曲心的糖多孢菌显著多于曲表;真菌主要由链格孢菌(Alternaria)、曲霉(Aspergillus)、隐球菌(Cryptococcus)、裸胞壳属(Emericella)、附球菌(Epicoccum)等构成(相对丰度和>92.6%),曲表的曲霉相对丰度更高,曲心的嗜热真菌更多;根据微生物群落聚类分析,手工曲发酵过程可以被分为0 d~6 d、6 d~19 d、19 d~60 d三个阶段。(2)机制生麦曲的群落结构演替规律分析。机制生麦曲中共检测到367个真菌属与1671个细菌属,主要真菌有曲霉、链格孢菌、附球菌等6个属(相对丰度和>83.0%),曲心根毛霉更多;主要细菌有芽孢杆菌、泛菌、糖多孢菌、葡萄球菌等12个属(相对丰度和>84.1%),曲心糖多孢菌显著多于曲表;聚类分析表明机制曲发酵过程可以分为0d~10 d、10 d~19 d、19 d~60 d三个阶段。(3)手工生麦曲与机制生麦曲的驱动力分析。通过对群落结构演替与环境因子动态变化的相关性分析,发现手工曲发酵初期与温度、含水量显著相关,中期与氧气显著相关,后期与环境因子无显著相关性;机制生麦曲发酵初期受到含水量与氧气的影响更大,发酵中期微生物群落基本稳定,后期真菌群落受到温度与含水量的共同作用,细菌群落与氧气显著相关。冗余分析表明,在整个发酵过程中,糖化力与手工曲的欧文氏菌(Erwina)、泛菌、镰刀菌(Fusarium)、链格孢菌、机制曲的考克氏菌(Kocuria)、葡萄球菌、芽孢杆菌、假丝酵母(Candida)成正相关,液化力与手工曲的假单胞菌、被孢霉(Mortierella)、毕赤酵母(Pichia)、机制曲的根毛霉(Rhizomucor)、嗜热真菌(Thermomyces)呈正相关。(4)生麦曲驱动力的验证。以酶活力为指标进行发酵阶段I的温度、初始加水量、曲块厚度的单因素验证,结果表明温度升高有助于糖多孢菌、小坂菌(Kosakonia)、根毛霉相对丰度的提高,且在50℃时有最高糖化酶活力,液化酶活力则随温度升高而降低;初始加水量主要影响曲霉、糖多孢菌、泛菌的群落结构,但19%的加水量时有最高糖化酶活力与较高的液化酶活力;7.5 cm厚度以上时有助于曲霉的生长,7.0 cm厚度以下时杂菌较多,酶活力与厚度成正相关。(5)生麦曲关键工艺优化及酿酒评价。对控制不同温度、加水量、厚度下生麦曲的微生物群落结构、酶活性质的测定与分析表明,对群落结构的驱动效果是厚度>温度>加水量,酶活性质受温度与厚度的影响较显著;基于单因素验证结果进行响应面优化实验,以最优条件培养温度51.5℃、初始加水量19%,厚度7.75 cm制成优化曲并进行优化曲的酿酒性能验证。结果表明,优化曲具有起酵速度快、残糖低、酸度低等优点,典型风味物质对比结果显示,优化曲黄酒有机酸总量偏低,主体香气物质与对照组无显著差异,但丁二酸二乙酯、苯酚、4-乙烯基愈创木酚含量偏高,正己醇、正丙醇、己酸乙酯含量偏低。综上,本论文以黄酒生麦曲为研究对象,采用高通量测序手段研究手工与机制黄酒生麦曲发酵过程的群落演替规律,阐明了驱动黄酒生麦曲微生物群落演替的主要环境因素,进一步通过对制曲工艺关键环境因素进行分析并优化了关键工艺,最后完成优化曲与手工曲、机制曲的应用评价。
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