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D-塔格糖作为一种新型功能性甜味剂,可广泛应用于食品、保健品、糖尿病药物和化学合成等行业。近年来,D-塔格糖的酶法生产逐渐成为了研究热点。该方法使用L-阿拉伯糖异构酶(AI)作为催化剂,将乳糖水解得到的D-半乳糖转化为D-塔格糖。该方法所需的反应条件温和,副产物少,符合绿色生产的理念。为了提高AI制备D-塔格糖的转化率和产量,本研究鉴定了一种来自于Bacillus coagulan NL01的新型AI,采用了基于计算建模的理性设计方法获得了突变酶,并将其应用到了D-塔格糖生产中。本论文包含以下几部分研究工作:(1)克隆了来源Bacillus coagulan NL01的AI(BCAI)编码基因(ara A),以p ETDuet-1质粒为载体构建了重组表达质粒,并在Escherichia coli BL21(DE3)中诱导表达。表达产物经镍柱纯化得到BCAI纯酶,纯化倍数约3.5倍。BCAI的单体分子量约为55 k Da,最适反应温度为60o C,最适反应p H为7.5,60o C具有较好的热稳定性。BCAI纯酶对金属离子敏感,EDTA处理后酶活明显损失,Mn2+、Co2+(0.5 m M)是其激活因子。BCAI纯酶对L-阿拉伯糖的kc at Km-1为8.7min-1 m M-1,对D-半乳糖的kcat Km-1为1.0 min-1 m M-1。(2)采用计算机同源建模方法,以Lactobacillus fermentum CGMCC2921 AI和E.coli AI的晶体结构为模板,构建了BCAI的分子模型。采用分子对接算法CDOCKER将L-阿拉伯糖、D-半乳糖对接入BCAI的活性中心。结果表明,L-阿拉伯糖在对接能量和氢键作用力上都比D-半乳糖更有利于酶催化。为了提高BCAI对D-半乳糖的催化能力,选取了氨基酸残基M185、F279、M349、I370、R186作为改造位点。丙氨酸扫描及粗酶酶活测定发现,F279、I370两个位点对酶的底物特异性影响最突出。对F279、I370的饱和突变及粗酶酶活测定发现,F279I的D-半乳糖酶活(0.63 U mg-1)高于野生酶(WT)(0.43 U mg-1),F279V的酶活与WT相当,而I370的四个突变型几乎完全失去对D-半乳糖的活力。(3)利用亲和镍柱纯化得到F279I纯酶。F279I催化D-半乳糖的最适温度为50o C,低于WT的最适温度;最适p H为8.0,稍高于WT的最适p H。F279I在最适条件下对L-阿拉伯糖的kcat Km-1为5.2 m M-1 min-1,对D-半乳糖的kcat Km-1为1.3 m M-1 min-1,两者之比为4.0:1,其对D-半乳糖的催化效率和特异性都比WT高。(4)全细胞催化制备D-塔格糖实验表明,含F279I的E.coli细胞的最适反应温度为50o C-70o C,而含WT的E.coli细胞的最适反应温度为60o C。在20 g L-1D-半乳糖条件下,前者反应转化率最高可达53%,比后者的最高转化率高出41%。在150 g L-1、250 g L-1D-半乳糖条件下,含F279I的E.coli细胞反应转化率可达45%、35.5%,D-塔格糖产量可达67.5 g L-1、88.3 g L-1,比含WT的E.coli细胞的反应转化率和D-塔格糖产量都提高了30%-40%。