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目的:
本研究主要分为两部分，第一部分主要是探讨不同全脑放疗时机联合EGFR-TKIs治疗携带EGFR突变的NSCLC伴随脑转移患者的临床疗效和生存期影响，观察EGFR-TKIs耐药情况;第二部分主要是探讨Hedgehog信号通路在EGFR突变NSCLC伴随脑转移EGFR-TKIs耐药中的作用及具体机制，分为三章。
分别以具有EGFR突变NSCLC伴随脑转移EGFR-TKIs敏感和耐药肺癌组织、构建的肺癌细胞PC9株(EGFR突变型，敏感株)继发EGFR-TKIs耐药的PC9-resistent(PC9-res)体外细胞实验模型和PC9-res裸鼠移植成瘤体内模型作为研究对象，全面检测了Hh信号通路在EGFR-TKIs敏感、继发耐药NSCLC BM中的表达差异，验证了SHH激活和shRNA-GLI1下调Hh信号通路对继发EGFR-TKIs耐药的影响，并观察Hh抑制剂和EGFR-TKIs联合用药在EGFR-TKIs耐药PC9-res裸鼠移植瘤中的疗效，探讨其作用机制，从而为临床治疗携带EGFR突变的NSCLC BM所出现的EGFR-TKIs继发耐药提供新的方向和策略。
方法:
1.不同全脑放疗时机联合EGFR-TKIs对EGFR突变非小细胞肺癌脑转移患者疗效观察
2.Hedgehog信号通路在EGFR突变非小细胞肺癌脑转移EGFR-TKI耐药中的作用及机制研究
2.1Hedgehog通路相关蛋白在EGFR-TKI耐药和敏感的NSCLC伴随脑转移肺癌组织中的表达及临床意义
2.2SHH激活和shRNA-GLI1下调Hh信号通路对非小细胞肺癌生物学特征影响的体外实验;
采用构建的非小细胞肺癌细胞PC9-res耐药细胞株和PC9细胞株作为实验对象，检测Hedgehog信号通路在激活、失活状态对EGFR-TKIs耐药PC9-res细胞株和PC9细胞株相关的影响;
2.3SHH激活和shRNA-GLI1下调Hh信号通路及Hedgehog抑制剂对非小细胞肺癌生物学特征的影响体内实验
建立裸鼠PC9细胞移植瘤模型，根据移植细胞株处理方法的不同，按照随机数字法，并设赋形剂为对照组，将裸鼠分为control(Ctr)组、SHH组;
建立裸鼠PC9-res细胞移植瘤模型，根据构建的vector和shRNA-GLI1慢病毒表达载体系统转染肺癌细胞株PC9-res移植慢病毒表达载体的不同，按照随机数字法，将裸鼠分为vector组、shRNA-1组、shRNA-2组;
接种2周成瘤后，等到肿瘤长到5mm的时候，开始定期测量肿瘤大小，待肿瘤长到8mm左右开始每天药物吉非替尼灌胃处理，gefitinib的给药剂量分别为20mg/kg，每周给药5天，连续给药。
2.3.1 观察SHH处理对移植瘤裸鼠移植瘤生长、瘤体大体标本质量、存活情况的影响。
2.3.2 Tunel染色法检测SHH处理PC9细胞株移植瘤对gefitinib诱导PC9凋亡的影响
2.3.3 观察不同慢病毒表达载体细胞株移植瘤对移植瘤裸鼠移植瘤生长、瘤体大体标本质量、存活情况的影响。
2.3.4 Tunel染色法检测不同慢病毒表达载体细胞株移植瘤对gefitinib诱导PC9-res凋亡的影响。
2.3.5 观察不同药物对移植瘤裸鼠移植瘤生长体积、存活情况、生存时间的影响
结果:
1.不同全脑放疗时机联合EGFR-TKIs对EGFR突变非小细胞肺癌脑转移患者疗效观察
A组、B组和C组颅内ORR分别为66.7％、85.3％和75％，两两比较差异均显著（P＜0.05）。A组、B组和C组颅内DCR分别为79.5％、94.1％和87.5％，B组DCR显著高于A组(P＜0.05)，但与C组无显著差异(P＞0.05)，A组与C组DCR比较无显著差异(P＞0.05)。A组、B组和C组中位OS分别为16.9个月(95％CI:13.852～20.264)、24.5个月（95％CI:19.967～28.984）和21.3个月(95％CI:17.785～24.861)，三组差异显著(P＜0.05)，B组显著高于A组和C组（P＜0.05）。A组、B组和C组中位颅内iPFS分别为6.8个月(95％CI:5.143～7.857)、12.4个月(95％CI:10.774～13.226)和9.1个月(95％CI:6.937～11.063)，三组差异显著(P＜0.05)，B组显著高于A组和C组(P＜0.05)。A组、B组和C组中位颅外ePFS分别为7.8个月(95％CI:7.392～8.208)、9.4个月(95％CI:7.867～10.533)和8.3个月(95％CI:6.755～9.245)，差异无统计学意义（P＞0.05）。三组患者不良反应多为1级或者2级，差异无统计学意义(P＞0.05)，均可耐受。
2.Hedgehog信号通EGFR突变非小细胞肺癌脑转移EGFR-TKI耐药中的作用及机制研究
2.1Hedgehog通路相关蛋白在EGFR-TKI耐药和敏感的NSCLC伴随脑转移肺癌组织中的表达及临床意义
2.2SHH激活和shRNA-GLI1下调Hh信号通路对非小细胞肺癌生物学特征影响的体外实验
2.3SHH激活和shRNA-GLI1下调Hh信号通路及Hedgehog抑制剂对非小细胞肺癌生物学特征影响的体内实验
2.3.1观察SHH处理其对PC-9细胞移植瘤裸鼠移植瘤生长、瘤体大体标本质量、存活情况的影响。
2.3.2Tunel染色法检测结果显示，较之于control组，SHH处理组裸鼠移植瘤中细胞凋亡显著降低，且组间差异比较具有统计学意义(P＜0.05)。
2.3.3观察shRNA-GLI1转染对PC9-res细胞移植瘤裸鼠移植瘤生长、瘤体大体标本质量、存活情况的影响。
2.3.4Tunel染色法检测结果显示，较之于vector组，shRNA-1组、shRNA-2组注射组裸鼠移植瘤中细胞凋亡显著增加，且组间差异比较具有统计学意义（P＜0.05）。
2.3.5观察EGFR-TKIs联合Hh抑制剂对PC9-res移植瘤裸鼠移植瘤生长体积、存活情况、生存时间的影响
裸鼠腋窝接种区平均2周左右出现移植瘤，3周后直径约0.3-0.5cm，接种的所有动物均存活下来，并在体形成了肿瘤，接种点无红肿、破溃等炎症反应。gefitinib联合GDC-0449组裸鼠精神、活动好，进食佳，其它三组精神、活动较差、进食少，gefitinib联合GDC-0449组裸鼠移植瘤体积均明显低于上述其他三组，差异显著，具有统计学意义(P＜0.05)，而在其它三组间没有差异，仅在联合用药组观察到显著的肿瘤抑制作用。
gefitinib联合GDC-0449组裸鼠移植瘤生存时间均明显高上述其他三组，差异显著，具有统计学意义(P＜0.05)，而在其它三组间没有差异，仅在联合用药组观察到显著的延长生存时间作用。
结论:
EGFR-TKIs与全脑放疗同步应用对比单独应用EGFR-TKIs或全脑放疗后序贯应用EGFR-TKIs能够有效改善EGFR突变NSCLC脑转移患者近期和远期疗效，而且没有增加其他不良反应，但不可避免的出现EGFR-TKIs耐药。
EGFR-TKIs敏感和继发耐药EGFR突变NSCLC脑转移肺癌组织中的Hh信号通路蛋白表达存在显著差异，在敏感细胞中处于失活状态，在继发耐药细胞中异常上调。Hh信号通路的异常激活可能作为EGFR突变的NSCLC对EGFR-TKIs耐药的机制之一;Hedgehog通路相关蛋白在EGFR-TKIs耐药的NSCLC中高表达且与病人预后呈负相关。
Hh信号通路在EGFR-TKI耐药细胞中异常上调，同时出现抑制E-cadherin的表达和促进N-cadherin和vimentin的表达等EMT表现，SHH处理后Hh信号通路激活，促进PC9对gefitinib耐药;构建的shRNA-GLI慢病毒表达载体转染PC9-res后，Hh信号通路失活，可反转PC9-res细胞EMT表型，并抑制PC9-res细胞的侵袭和转移，促进EGFR-TKI诱导的细胞凋亡。
肺癌PC9细胞裸鼠移植瘤模型及肺癌PC9-res细胞移植瘤模型构建成功，SHH处理后Hh信号通路激活，促进gefitinib耐药，能够明显促进裸鼠移植瘤的生长，抑制肿瘤细胞的凋亡;shRNA-GLI1下调后Hh信号通路失活，逆转gefitinib耐药，能够明显抑制裸鼠移植瘤的生长，促进肿瘤细胞的凋亡。EGFR-TKI与Hh信号通路抑制剂联合可协同逆转PC9-res细胞对EGFR-TKI的敏感性，抑制移植瘤的大小，延长EGFR-TKI耐药细胞移植瘤裸鼠生存时间。
本研究主要分为两部分，第一部分主要是探讨不同全脑放疗时机联合EGFR-TKIs治疗携带EGFR突变的NSCLC伴随脑转移患者的临床疗效和生存期影响，观察EGFR-TKIs耐药情况;第二部分主要是探讨Hedgehog信号通路在EGFR突变NSCLC伴随脑转移EGFR-TKIs耐药中的作用及具体机制，分为三章。
分别以具有EGFR突变NSCLC伴随脑转移EGFR-TKIs敏感和耐药肺癌组织、构建的肺癌细胞PC9株(EGFR突变型，敏感株)继发EGFR-TKIs耐药的PC9-resistent(PC9-res)体外细胞实验模型和PC9-res裸鼠移植成瘤体内模型作为研究对象，全面检测了Hh信号通路在EGFR-TKIs敏感、继发耐药NSCLC BM中的表达差异，验证了SHH激活和shRNA-GLI1下调Hh信号通路对继发EGFR-TKIs耐药的影响，并观察Hh抑制剂和EGFR-TKIs联合用药在EGFR-TKIs耐药PC9-res裸鼠移植瘤中的疗效，探讨其作用机制，从而为临床治疗携带EGFR突变的NSCLC BM所出现的EGFR-TKIs继发耐药提供新的方向和策略。
方法:
1.不同全脑放疗时机联合EGFR-TKIs对EGFR突变非小细胞肺癌脑转移患者疗效观察
2.Hedgehog信号通路在EGFR突变非小细胞肺癌脑转移EGFR-TKI耐药中的作用及机制研究
2.1Hedgehog通路相关蛋白在EGFR-TKI耐药和敏感的NSCLC伴随脑转移肺癌组织中的表达及临床意义
2.2SHH激活和shRNA-GLI1下调Hh信号通路对非小细胞肺癌生物学特征影响的体外实验;
采用构建的非小细胞肺癌细胞PC9-res耐药细胞株和PC9细胞株作为实验对象，检测Hedgehog信号通路在激活、失活状态对EGFR-TKIs耐药PC9-res细胞株和PC9细胞株相关的影响;
2.3SHH激活和shRNA-GLI1下调Hh信号通路及Hedgehog抑制剂对非小细胞肺癌生物学特征的影响体内实验
建立裸鼠PC9细胞移植瘤模型，根据移植细胞株处理方法的不同，按照随机数字法，并设赋形剂为对照组，将裸鼠分为control(Ctr)组、SHH组;
建立裸鼠PC9-res细胞移植瘤模型，根据构建的vector和shRNA-GLI1慢病毒表达载体系统转染肺癌细胞株PC9-res移植慢病毒表达载体的不同，按照随机数字法，将裸鼠分为vector组、shRNA-1组、shRNA-2组;
接种2周成瘤后，等到肿瘤长到5mm的时候，开始定期测量肿瘤大小，待肿瘤长到8mm左右开始每天药物吉非替尼灌胃处理，gefitinib的给药剂量分别为20mg/kg，每周给药5天，连续给药。
2.3.1 观察SHH处理对移植瘤裸鼠移植瘤生长、瘤体大体标本质量、存活情况的影响。
2.3.2 Tunel染色法检测SHH处理PC9细胞株移植瘤对gefitinib诱导PC9凋亡的影响
2.3.3 观察不同慢病毒表达载体细胞株移植瘤对移植瘤裸鼠移植瘤生长、瘤体大体标本质量、存活情况的影响。
2.3.4 Tunel染色法检测不同慢病毒表达载体细胞株移植瘤对gefitinib诱导PC9-res凋亡的影响。
2.3.5 观察不同药物对移植瘤裸鼠移植瘤生长体积、存活情况、生存时间的影响
结果:
1.不同全脑放疗时机联合EGFR-TKIs对EGFR突变非小细胞肺癌脑转移患者疗效观察
A组、B组和C组颅内ORR分别为66.7％、85.3％和75％，两两比较差异均显著（P＜0.05）。A组、B组和C组颅内DCR分别为79.5％、94.1％和87.5％，B组DCR显著高于A组(P＜0.05)，但与C组无显著差异(P＞0.05)，A组与C组DCR比较无显著差异(P＞0.05)。A组、B组和C组中位OS分别为16.9个月(95％CI:13.852～20.264)、24.5个月（95％CI:19.967～28.984）和21.3个月(95％CI:17.785～24.861)，三组差异显著(P＜0.05)，B组显著高于A组和C组（P＜0.05）。A组、B组和C组中位颅内iPFS分别为6.8个月(95％CI:5.143～7.857)、12.4个月(95％CI:10.774～13.226)和9.1个月(95％CI:6.937～11.063)，三组差异显著(P＜0.05)，B组显著高于A组和C组(P＜0.05)。A组、B组和C组中位颅外ePFS分别为7.8个月(95％CI:7.392～8.208)、9.4个月(95％CI:7.867～10.533)和8.3个月(95％CI:6.755～9.245)，差异无统计学意义（P＞0.05）。三组患者不良反应多为1级或者2级，差异无统计学意义(P＞0.05)，均可耐受。
2.Hedgehog信号通EGFR突变非小细胞肺癌脑转移EGFR-TKI耐药中的作用及机制研究
2.1Hedgehog通路相关蛋白在EGFR-TKI耐药和敏感的NSCLC伴随脑转移肺癌组织中的表达及临床意义
2.2SHH激活和shRNA-GLI1下调Hh信号通路对非小细胞肺癌生物学特征影响的体外实验
2.3SHH激活和shRNA-GLI1下调Hh信号通路及Hedgehog抑制剂对非小细胞肺癌生物学特征影响的体内实验
2.3.1观察SHH处理其对PC-9细胞移植瘤裸鼠移植瘤生长、瘤体大体标本质量、存活情况的影响。
2.3.2Tunel染色法检测结果显示，较之于control组，SHH处理组裸鼠移植瘤中细胞凋亡显著降低，且组间差异比较具有统计学意义(P＜0.05)。
2.3.3观察shRNA-GLI1转染对PC9-res细胞移植瘤裸鼠移植瘤生长、瘤体大体标本质量、存活情况的影响。
2.3.4Tunel染色法检测结果显示，较之于vector组，shRNA-1组、shRNA-2组注射组裸鼠移植瘤中细胞凋亡显著增加，且组间差异比较具有统计学意义（P＜0.05）。
2.3.5观察EGFR-TKIs联合Hh抑制剂对PC9-res移植瘤裸鼠移植瘤生长体积、存活情况、生存时间的影响
裸鼠腋窝接种区平均2周左右出现移植瘤，3周后直径约0.3-0.5cm，接种的所有动物均存活下来，并在体形成了肿瘤，接种点无红肿、破溃等炎症反应。gefitinib联合GDC-0449组裸鼠精神、活动好，进食佳，其它三组精神、活动较差、进食少，gefitinib联合GDC-0449组裸鼠移植瘤体积均明显低于上述其他三组，差异显著，具有统计学意义(P＜0.05)，而在其它三组间没有差异，仅在联合用药组观察到显著的肿瘤抑制作用。
gefitinib联合GDC-0449组裸鼠移植瘤生存时间均明显高上述其他三组，差异显著，具有统计学意义(P＜0.05)，而在其它三组间没有差异，仅在联合用药组观察到显著的延长生存时间作用。
结论:
EGFR-TKIs与全脑放疗同步应用对比单独应用EGFR-TKIs或全脑放疗后序贯应用EGFR-TKIs能够有效改善EGFR突变NSCLC脑转移患者近期和远期疗效，而且没有增加其他不良反应，但不可避免的出现EGFR-TKIs耐药。
EGFR-TKIs敏感和继发耐药EGFR突变NSCLC脑转移肺癌组织中的Hh信号通路蛋白表达存在显著差异，在敏感细胞中处于失活状态，在继发耐药细胞中异常上调。Hh信号通路的异常激活可能作为EGFR突变的NSCLC对EGFR-TKIs耐药的机制之一;Hedgehog通路相关蛋白在EGFR-TKIs耐药的NSCLC中高表达且与病人预后呈负相关。
Hh信号通路在EGFR-TKI耐药细胞中异常上调，同时出现抑制E-cadherin的表达和促进N-cadherin和vimentin的表达等EMT表现，SHH处理后Hh信号通路激活，促进PC9对gefitinib耐药;构建的shRNA-GLI慢病毒表达载体转染PC9-res后，Hh信号通路失活，可反转PC9-res细胞EMT表型，并抑制PC9-res细胞的侵袭和转移，促进EGFR-TKI诱导的细胞凋亡。
肺癌PC9细胞裸鼠移植瘤模型及肺癌PC9-res细胞移植瘤模型构建成功，SHH处理后Hh信号通路激活，促进gefitinib耐药，能够明显促进裸鼠移植瘤的生长，抑制肿瘤细胞的凋亡;shRNA-GLI1下调后Hh信号通路失活，逆转gefitinib耐药，能够明显抑制裸鼠移植瘤的生长，促进肿瘤细胞的凋亡。EGFR-TKI与Hh信号通路抑制剂联合可协同逆转PC9-res细胞对EGFR-TKI的敏感性，抑制移植瘤的大小，延长EGFR-TKI耐药细胞移植瘤裸鼠生存时间。