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猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)是由猪圆环病毒2型(PCV2)引起的重要传染病之一,临床上可以引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎和肾病综合征(PDNS)、呼吸道疾病、繁殖障碍和先天震颤等多种疾病,给全球的养猪业带来了巨大经济损失。Cap蛋白是PCV2的主要免疫原性蛋白,具有多个表位,是研究PCV2血清学诊断方法和疫苗免疫的重要蛋白。本研究构建了表达PCV2Cap蛋白的重组杆状病毒和昆虫细胞系,并进行了免疫特性研究,为PCV2亚单位疫苗的研究奠定了重要基础。具体研究内容如下：1.表达PCV2Cap蛋白的重组杆状病毒的构建和鉴定本研究以密码子优化的PCV2ORF2基因为基础,设计了6对引物,通过PCR扩增了多种ORF2片段,分别克隆到昆虫杆状病毒表达系统的pFastBac供体质粒上,经PCR、双酶切和测序鉴定得到正确的重组供体质粒。再用该重组供体质粒转化DH10Bac感受态细菌,经两轮蓝白斑筛选和PCR鉴定后,得到了正确的重组Bacmid。在脂质体介导下,用重组Bacmid转染Sf9昆虫细胞,得到了7种重组杆状病毒,SDS-PAGE、Westernblot、间接免疫荧光、夹心ELISA和电镜观察的结果表明,重组Cap蛋白得到了正确的表达,具有良好的反应原性,可作为PCV2亚单位疫苗候选抗原。2.表达PCV2Cap蛋白的昆虫细胞系的建立和鉴定本实验旨在构建表达PCV2Cap蛋白的重组质粒,并建立稳定表达Cap蛋白的昆虫细胞系。利用PCR扩增去核定位信号(NLS)的PCV2ORF2基因,连接到真核表达载体pMIB-V5/HisA,经双酶切和测序鉴定,得到重组质粒pMIB-V5/HisA-cap.在脂质体介导下,用重组质粒转染Sf21和HF细胞,通过Blasticidin筛选抗性细胞,经Westernblot检测cap蛋白的表达。结果表明,cap蛋白重组表达载体pMIB-V5/HisA-cap构建正确,转染细胞,经Blasticidin筛选到表达cap蛋白的昆虫细胞系。Western blot结果说明,表达的重组cap蛋白具有良好的反应原性,为PCV2基因工程亚单位疫苗的研发提供了新的思路。3.杆状病毒表达的PCV2Cap蛋白免疫特性研究本研究以重组杆状病毒rBcapokm表达的Cap蛋白制备疫苗并免疫动物,以评价其免疫效果。小鼠免疫试验表明,以rBcapokm为基础制备的CPH和CP两种疫苗都能诱导机体产生PCV2特异的体液和细胞免疫应答。猪体免疫保护实验结果为：首免3周后即可检测到ELISA抗体,2免2周后抗体水平进一步升高,与此同时,CPH组中和抗体水平达到了1：102,高于iPCV2组的1：90。攻毒后,亚单位疫苗和灭活苗都能为攻毒仔猪提供免疫保护,具体表现为免疫组临床症状不明显,病毒血症较轻,淋巴结和肺脏组织病理变化不明显,淋巴结组织病毒载量较低。其中CPH组的淋巴结PCV2含量低于iPCV2组,表明重组杆状病毒rBcapokn表达的Cap蛋白具有较好免疫保护作用。综上所述,本研究在密码子优化过的ORF2基因的基础上,构建了表达PCV2Cap蛋白的重组杆状病毒和昆虫细胞系。动物实验结果表明,重组杆状病毒表达的Cap蛋白具有良好的免疫原性,能够诱导机体产生免疫应答,并对攻毒猪提供了足够的免疫保护作用,具有开发应用价值。