水稻OsGH3家族第一组基因的分离克隆和功能初步验证

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水稻是我国和世界上最重要粮食作物之一,一直以来,病害都是影响水稻产量和品质的一个重要因素。探索植物的抗病机理有助于控制植物病害的发生,减少植物病害所带来的损失。植物抗病反应是一个复杂的过程,涉及众多抗病基因和抗病相关基因。而与抗病基因相比,抗病相关基因具有持久抗性和广谱抗性的优点。本研究旨在对水稻中的生长素早期相应基因家族——水稻GH3家族第一组基因在抗病反应中发挥的功能进行初步探索,为水稻抗病机理的研究准备可用的材料,为水稻抗病育种提供可用的基因资源。我们利用农杆菌介导的遗传转化方法分别在中度感病的粳稻材料对Os GH3家族第一组的四个基因进行超量表达和RNA干扰抑制表达。通过实时定量PCR和反转录PCR检测转基因材料的目的基因表达量,表明各个转基因材料中目的基因均与预期相符的被超量表达或抑制表达。对转基因植株和野生型对照中花11接种白叶枯菌PXO347以验证目的基因表达量变化是否对水稻与病原菌的互作造成影响,发现Os GH3.3的两个转录本,Os GH3.5,Os GH3.6和Os GH3.12的超量表达材料中大部分目的基因表达量高的植株呈现出病斑面积缩小的表型,进行T1代共分离分析发现,上述表型与Os GH3家族第一组超量表达的基因型除个别单株外均存在共分离。而这四个基因的抑制表达材料接种则未发现明显表型,大部分目的基因被成功抑制的植株病斑面积与野生型无显著差异,而个别几株材料发病面积显著增加或减小的情况可能是由于田间条件带来的的随机误差引起的,T1代共分离分析结果也证实了这一结论。前人的研究大多表明了Os GH3家族基因功能存在冗余,这可能是Os GH3家族第一组基因抑制表达后发病情况无显著差异的原因,因此在四个转基因抑制材料都收到种子之后,于2014年冬季将阳性植株的种子在海南进行两两杂交,已获得双突变体来验证Os GH3家族第一组基因抑制表达对水稻抗白叶枯反应的影响。通过原核低温表达的方法,在体外表达并纯化了除Os GH3.6外的带有His标签的Os GH3第一组蛋白,并且得到了符合预期大小的可溶性蛋白。通过体外酶活测定,发现目前表达纯化的四个GH3第一组蛋白都有介导茉莉酸和游离异亮氨酸形成复合物的能力。同时为对Os GH3第一组蛋白的生化功能的进一步研究准备了材料。
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