论文部分内容阅读
甘蔗花叶病(Sugarcane mosaic disease)是甘蔗(Saccharum spp.)的主要病毒性病害,并对甘蔗生产造成较大的损失,抗病育种是最有效的控制方法。尽管已在甘蔗属细茎野生种(Saccarum spontaneum)、大茎野生种(Saccharum robustum)等物种上发现了丰富的抗花叶病种质资源,但甘蔗热带种(Saccharum officinarum)高感花叶病,现代甘蔗育种又是以热带种为母本的“高贵化”育种过程并含有80%以上的热带种血缘,因而,来自热带种控制产量、糖分与感花叶病性状的基因并存,并存在不利的连锁,导致基于表型选择的传统杂交育种对甘蔗花叶病抗性的改良效果差。病害样品的调查发现高粱花叶病毒(Sorghum mosaic virus,SrMV)为我国糖料甘蔗的绝对优势病原,在主产区广西的感病率达30%。为此,本研究以近10余年来占我国甘蔗栽培面积60%以上的甘蔗品种ROC22的3类甘蔗植株的叶片作为材料,获得其转录组测序数据,并进一步利用生物信息学分析技术、基因克隆技术、实时荧光定量PCR技术以及基因芯片技术等,率先从转录水平,认识甘蔗与SrMV的分子互作,构建两者互作的甘蔗unigene库,探究甘蔗响应病毒侵染的相关代谢与病程相关基因的变化,挖掘甘蔗与病毒互作的宿主因子以及抗病或防御相关基因,为甘蔗抗花叶病育种提供候选基因资源和潜在的病程相关功能基因。因此,课题研究具有重要的理论意义和实际应用价值。本论文的研究内容、主要研究结果与结论如下:1.甘蔗内参基因的评价与筛选。甘蔗功能基因挖掘被广泛重视,鉴于内参基因对目标基因表达的定量结果影响大,不同条件下又需要不同的内参基因,为此,本研究以gNorm、NormFinder、BestKeeper和deltaCt这四种方法,分别对33个候选内参基因和12个候选miRNA内参在3个甘蔗基因型的花叶病样品中、13个候选内参基因在5个甘蔗基因型的5种组织样品、13个候选内参基因在4个甘蔗基因型的8类胁迫处理样品中进行了系统评价,以方便研究人员利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术,对甘蔗功能基因进行表达特性研究。其中:(ⅰ)PP2A和miR159分别是ROC22、FN40、FN15样品中SrMV侵染条件下表达最稳定的内参基因和最适的miRNA内参;(ⅱ)GAPDH是ROC22、ROC20、FN40、柳城03-182和崖城05-179组织样品中最理想的内参基因;(ⅲ)是激素处理条件下最佳的内参因子;(ⅳ)是8类(NaCl、PEG、H2O2、CuCl2、CdCl2、ABA、SA和JA)胁迫处理条件下表达最稳定的内参基因;APRT是重金属(CuCl2和CdCl2)胁迫条件下甘蔗中最佳的内参因子。此外,在一些实验当中,如果多内参组合是不可或缺的要求,那么,CAC+CUL组合适用于花叶病胁迫、非生物胁迫、干旱、重金属等多种处理因素,eEF-1a+GAPDH适用于激素处理下的甘蔗基因表达定量,miR171+miR1520适用于花叶病相关甘蔗miRNA表达定量。2.转录组测序与分析。本研究以2个无花叶病症状且不带病毒和1个有花叶病症状且带SrMV的甘蔗ROC22蔗苗叶片RNA作为材料,利用IluminaHiseq2000测序平台,获得高质量的转录组数据。最终结果显示共获得了 88,414条具有完整ORF的Unigenes,其中70,309条Unigenes能够在NCBI_Nr、NCBI_Nt、SwissProt、TrEMBL、GO、COG或KEGG数据库上找到同源序列注释信息,这些序列还包含了 potyvirus宿主互作因子,其中eEF1A、PCaP1、rgs-CaM、SGS3响应SrMV侵染,在ROC22不带病毒的非转基因植株和带SrMV且有花叶症状的非转基因植株之间差异表达倍数超过2(表3.10)。差异基因的生物信息学分析表明:在甘蔗受SrMV侵染过程中,植物乙烯和水杨酸激素信号、钙信号、光合合成、色素代谢、植物-病原互作、酶活性调节/抑制、碳水化合物合成等相关代谢通路发生了积极的响应,68个差异表达基因包括M4PKK5、PP2C、MYB、WRKY、NPR1等被注释到上述代谢通路中。3.甘蔗RNA-seq和表达谱芯片综合分析。分析结果显示,不同抗性水平甘蔗品种具有不同的响应花叶病侵染基因表达谱,具体表现为抗性水平越低,病毒相对积累量越高,且易感病品种受抑制表达的基因多于受诱导表达的基因,而抗性品种则相反;易感品种中参与叶片细胞基础代谢活动如光合作用、碳固定、色素合成等的基因更容易受到SrMV侵染的影响。基因的表达定量分析表明,SrMV侵染后,甘蔗生长素、细胞分裂素、乙烯、水杨酸、茉莉酸5个激素信号通路上,多个乙烯响应转录因子、细胞分裂素双元信号系统调控因子、生长素响应元件、茉莉酸甲基转移酶基因均发生显著差异表达。SrMV可能还通过与叶绿体蛋白互作而影响叶绿体生理功能和结构,进而释放钙离子,激活钙离子信号通路,导致CRT、CIPK等钙离子相关基因的差异表达以及一些叶绿体定位基因的差异表达。这些钙和激素等初级信号激发了一系列的植物防御反应。Pan1、LRR-RLKs、Lec-RLKs、乙烯响应转录因子、WRKY转录因子、bHLH转录因子及MAPKs激酶、RNA结合蛋白基因、X1、SGS3、RH8等调控相关基因均发生了表达变化,且WRKY、WRKY53、MAP3K、G3、G26和SGS3在表达趋势上存在显著的相关性。值得强调的是,表达谱芯片和qRT-PCR在基因表达数据归一化方法、相对表达倍数统计方法上存在差别,导致个别数据产生表达量偏差,但两者数据之间还是存在较高的一致性,说明利用转录组内Unigenes作为探针靶序列,定制甘蔗表达谱芯片,能够获得相对真实的基因表达数据。这一研究结果说明,利用高通量测序技术获得高质量Unigene序列作为表达谱芯片的参考,相对于单纯利用高通量测序技术检测基因表达谱,既能降低成本又不失定量的准确性。4.基因功能鉴定。表达定量分析结果表明ScSCE1受SrMV侵染诱导表达;ScSNARE、ScSGS3和ScX1在SrMV侵染样品中表达趋势较为一致,且两两间存在显著的正相关,同时,均表现为在易感品种中表达下调,而在抗性品种中则相反;ScSNARE、ScSGS3和ScX1蛋白三维结构分析表明三者是潜在的互作因子。ScSCE1在三维结构上与拟南芥AtSCE1和烟草NbSCE1几乎完全一致,同时能够在酵母双杂交系统上与SrMV NIb发生互作,说明ScSCE1是甘蔗上SrMV宿主互作因子。此外,ScSCE1无明显的组织特异性表达,在ROC22组培苗上的表达受SA和JA抑制而受ABA信号通路诱导,。相对叶组织而言,ScSNARE在甘蔗新陈代谢活跃的组织如节间、芽和茎尖上的表达量更高,同时ScSNARE明显受激素信号调控,尤其受ABA信号通路诱导。ScSGS3和ScX1蛋白序列上都含有能够与VPg发生互作的ZnF保守结构域。