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研究目的:1、检测肺腺癌A549细胞和A549干细胞球谷胱甘肽合成相关基因mRNA和蛋白表达水平和凋亡相关蛋白表达情况。2、观察肽核酸-三苯磷(peptide nucleic acids-triphenylphosphine,PNA-TPP)对肺腺癌A549干细胞球谷胱甘肽抗氧化系统及顺铂耐药的影响。3、初步探讨PNA-TPP靶向调节谷胱甘肽抗氧化系统的调控机制。方法:1、无限稀释法挑选出紧密型单克隆细胞,使用无血清培养基(serum-free medium,SFM)的方法培养形成A549细胞球体。2、CCK8试剂盒检测不同浓度顺铂条件下A549细胞及A549干细胞球的增殖抑制率及计算顺铂的IC50半数(最大抑制浓度)。3、试剂盒检测A549细胞及A549干细胞球胞浆内ATP、氧化性谷胱甘肽GSSH、还原性谷胱甘肽GSH、总谷胱甘肽、活性氧等物质含量水平。4、Western Blot检测A549及A549干细胞球组GCLC、GCLM、GSS、x-CT蛋白表达水平及RT-PCR检测GCLC、GCLM、GSS、x-CT mRNA表达水平。5、使用固相肽的方法构建反义肽核酸-三苯磷复合物(反义PNA-TTP),Western Blot检测PNA-TPP转染A549及A549干细胞球对谷胱甘肽合成相关基因表达的影响。6、使用流式细胞仪检测PNA-TPP转染和或联合顺铂处理A549干细胞球后的凋亡水平变化,Western Blot检测PNA-TPP转染和或联合顺铂处理A549干细胞球后凋亡相关蛋白表达变化。7、试剂盒分别检测PNA-TPP转染和或联合顺铂处理A549干细胞球后胞浆内ATP、还原性谷胱甘肽(GSH)、活性氧(ROS)等物质水平的变化情况。8、GCLC过表达质粒及SiRNA-GCLC转染A549干细胞球,荧光显微镜观察其转染效率,Western blot和RT-PCR检测GCLC表达水平,验证其转染效果并筛选出最合适的干扰片段。9、Western blot检测A549干细胞球及GCLC质粒转染联合PNA-TTP处理后GCLC表达水平的影响,试剂盒检测各组谷胱甘肽水平变化。结果:1、成功挑选出紧密型单克隆及无血清培养基成功诱导形成A549干细胞球体,倒置相差显微镜观察到每个球体内有几百到上千个细胞,且透光性良好。2、随处理的顺铂浓度的增加,A549细胞及A549干细胞球的增殖抑制率增高,Capase3、Bax的表达水平增加,Bcl-2的表达水平降低,且A549细胞的增殖抑制率普遍高于A549干细胞球。A549干细胞球内IC50高于A549细胞(9.191±0.4638 VS 5.109±0.1608 mg/ml)。3、成功合成的PNA-TPP复合物,经鉴定为检测为单峰,且未见其他杂质峰,纯度良好。4、与A549细胞相比,A549干细胞球内GSSG、GSH、总GSH含量增加,ROS、ATP含量减少。GCLC、GSS、xCT mRNA及蛋白表达水平增加,GCLM mRNA及蛋白表达水平较少。PNA-TPP转染A549细胞及A549细胞球后,两组GCLM、GSS、xCT蛋白表达水平均增加,而GCLC蛋白表达水平均降低。5、与空白对照组相比,A549干细胞球经PNA-TPP或顺铂单药处理后,Capase3、Bax的表达水平增加,Bcl-2的表达水平降低,凋亡率增加,两组间差异无统计学意义;A549干细胞球经PNA-TPP联合顺铂处理后,Capase3、Bax的表达水平明显增加,Bcl-2的表达水平明显降低,凋亡率增加,与单药处理组相比,变化更加明显,差异具有统计学意义。6、与空白对照组相比,A549干细胞球经PNA-TPP或顺铂单药处理后,GSH、ATP含量降低,ROS含量增加;A549干细胞球经PNA-TPP联合顺铂处理后,GSH、ATP含量明显降低,ROS含量明显增加,与单药处理组相比,变化更加明显,差异具有统计学意义。7、siRNA-GCLC可下调A549干细胞球中GCLC mRNA及蛋白的表达;GCLC过表达质粒组(NC+OE-GCLC)组可上调A549干细胞球中GCLC mRNA及蛋白的表达。siRNA-GCLC转染A549干细胞球后,联合PNA-TPP处理,可进一步下调GCLC的表达;(NC+OE-GCLC)组转染A549干细胞球后,联合PNA-TPP转处理,可抑制GCLC的上调。结论:1、与A549细胞相比,A549干细胞球内谷胱甘肽的生物合成增强。2、PNA-TPP靶向进入线粒体通过降低GCL酶催化亚基GCLC表达,抑制A549干细胞内谷胱甘肽的生物合成,促进肿瘤干细胞凋亡,从而增强顺铂化疗敏感性。