人类疾病往往是环境因素与遗传因素共同作用的结果，人体对环境因素易感的基因也非常多，探讨基因与环境的相互作用，有利于我们掌握环境诱导疾病的分子遗传机制。1998年，周建伟等人从培养的原代人的气管和支气管上皮细胞中，利用差异显示高通量筛选技术，分离克隆了一个在生物进化上高度保守的环境应答基因——JWA基因，其编码蛋白在细胞内的分布酷似微管蛋白，并受多种分化诱导剂如维甲酸(RA)、13顺-维甲酸(13-cRA)和佛波酯(TPA)等调控，可能参与了诱导急性早幼粒细胞性白血病细胞分化和凋亡，以及环境热应激、氧化应激应答的信号转导通路。国外研究人员最近连续报道，与JWA基因几乎完全同源的大鼠E18表达的蛋白GTRAP3-18可能是一种与Na~+依赖的谷氨酸转运体EAAT3相关作用的新蛋白，并且负调控EAAT3介导的谷氨酸摄取。本研究内容共为二个部分：第一，在结构上探讨JWA蛋白与微管蛋白之间的关系；第二，进一步研究JWA蛋白参与调节PC12细胞内氨基酸转运，特别是谷氨酸-牛磺酸平衡的功能。 南京医科大学硕士学位论文 第一部分JWA蛋白与微管蛋白相关性的研究 针对微管动力学、微管及其相关蛋白共纯化的特性，我们采用4℃解聚一3 7 C聚合循环法纯化和提取了 SD大鼠脑组织中微管及其相关蛋白，发现 JWA蛋白也同时伴随微管蛋白共纯化而非是污染性蛋白，说明 JWA蛋白是一种特异性地与微管蛋白相互作用的分子；在用微管解聚剂门0HM诺考达哇）处理及对照的NIH3T3细胞裂解液进行免疫共沉淀实验中，结果表明无论微管处于解聚或聚合状态，p－微管蛋白均可与JWA蛋白免疫共沉淀；免疫胶体金法电子显微镜技术显示JWA蛋白与微管蛋白在超微结构水平上有共定位。激光共聚焦检测显示JWA基因编码蛋白定位于细胞浆中，核周围分布比较密集，呈放射网络状分布直达细胞膜，酷似微管蛋白。双重荧光素染色实验中观察发现JWA蛋白与p－微管蛋白分布平行，有共定位，这一结果与免疫胶体金电镜实验结果相吻合。秋水仙素和诺考达哇处理 HBE细胞后，JWA和微管均发生解聚；低温（4C）处理转染pCMVflag刁WA的 HBE细胞后发现微管发生解聚，而 JWA未受明显影响；但在另一实验模型中显示，低温（4C）、终浓度为 10州的秋水仙素分别处理 NIH3T3细胞 0、30、60、1叨分钟后，微管和J他均不同程度地发生解聚。用m卜M J帅反义寡核菩酸处理NIH3T3细胞24，1、时后；J狐蛋白表达明显下降。用50pM的秋水仙素处理细胞，发现J皿蛋白在细胞分裂间期中的分布与p－微管蛋白基本一致，而在细胞分裂中期中，JWA蛋白好象包绕在纺锤丝周围，成为纺锤丝的包裹。 第二部分TWA蛋白参与调节PC12细胞内氨基酸的平衡 用针对JWAcDNA不同部位及不同修饰的六种反义寡核普酸处理PC圭月后（10HM，二hL各处理组细月 内20种氨基酸总量以及抑制性氨基酸：甘氨酸，Y氨基丁酸和牛磺酸，兴奋性氨基酸：谷氨酸和天冬氨酸的含量均比对照组有不同程度增加，其中六种不同的反义寡核菩酸中以和对PC12细胞内氨基酸转运的影响最为显著（P＜0．of）；两类氨基酸中又分别以牛磺酸（P＜0．of）和 3 南京医科大学硕士学位论文谷氨酸o刃．01）受到的影响最为显著，J皿反义寡核旮酸对细胞内两类氨基酸转运影响大小次序为：牛磺酸＞抑制性总氨基酸＞谷氨酸＞兴奋性总氨基酸卜－氨基丁酸＞甘氨酸＞天冬氨酸。 综上实验结果表明JWA蛋白是一种新的微管相关蛋白，与微管分布基本平行，在绝大多数情况下伴随微管动力学（聚合或解聚）变化而同步发生变化，并且可能对细胞有丝分裂中微管重组、染色体移动等发挥了一定的作用；同时JWA蛋白也是细胞内负性调节氨基酸含量的一种重要蛋白，选择性地调节了细胞内谷氨酸和牛磺酸的平衡。