越南火龙果种子白蛋白的iTRAQ蛋白质组学分析与应用

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目的:火龙果产量高,营养功效和经济价值良好。其成分之一:植物白蛋白有解毒、抗氧化、抗疲劳等功能,起泡性、乳化性,保湿和滋润功效良好。然而目前,关于火龙果白蛋白的功能应用研究不多。本课题利用白蛋白溶于水的特性,用改进的Osborne法提取了火龙果种子白蛋白;对火龙果种子白蛋白进行了组分分析和生物信息学分析;最后设计出了一款火龙果种子白蛋白保湿霜,讨论了相关配方工艺和原料选取等问题,初步制定了该产品的制备参数。主要研究内容如下:(1)摸索出火龙果种子白蛋白的适宜提取条件,脱脂火龙果种子与水配比为1:50,p H 6,在50℃的条件下提取3 h,10 000 r/min离心30 min,收集上清液。收集的上清液调到4.0~5.0(白蛋白的等电点值),静置1 h,10 000 r/min离心40 min,收集沉淀。用灭菌的去离子水(p H 6.0)溶解沉淀,离心,取上清,得白蛋白粗提液。把硫酸铵固体缓慢、少量多次地加入到白蛋白粗提液中,饱和后,调节p H 4~5,室温放置1 h,6 000 r/min离心,收集沉淀,4℃冰箱保存。将上述经过硫酸铵纯化的白蛋白溶液装入透析袋中(已灭菌),截留分子量3 000 Da,置于4℃的蒸馏水中透析48 h。期间多次更换蒸馏水以提高透析率,最后一次换水后保证透析2 h以上,4℃保存。此时火龙果种子白蛋白的提取率最高,可达到6 mg/g。火龙果种子白蛋白的分子量分布主要集中在10~20 k Da。(2)本实验对越南红心和白心火龙果种子白蛋白进行了定量蛋白质组学分析和生物信息学分析,首先对越南红心和白心火龙果种子白蛋白进行提取,SDS-PAGE鉴定蛋白质量后,经过酶解、i TRAQ(Isobaric tags for relative and absolute quantification)肽段标记、SCX分级、LC-MS/MS,可用Proteome Discoverer 2.2软件进行数据库搜索,谱肽、蛋白定量。之后对其进行GO(gene ontology)注释、COG(Cluster of Ontology Groups of proteins)注释和显著性差异分析。结果表明,此过程共鉴定到蛋白104个,共有25个差异表达蛋白,包括13个上调蛋白和12个下调蛋白。生物信息学的分析表明,GO注释显示白蛋白涉及16种生物过程,3种细胞组分和11种分子功能。COG注释主要将白蛋白分为14类,集中在碳水化合物的代谢和运输,细胞骨架,无机离子的运输与代谢,细胞内运输、分泌与囊泡运输,核苷酸转运与代谢,翻译后修饰、蛋白质折叠和分子伴侣,RNA加工和修饰,转录次生代谢产物的生物合成、运输和分解代谢,翻译、核糖体结构和生物发生等。预测26种白蛋白亚细胞定位、跨膜区域、信号肽和磷酸化位点。亚细胞定位推测白蛋白可能出现在细胞的任何部位。具有跨膜区域的只有A0A7C9EY80、A0A7C8YKA6。有信号肽的只有A0A7C8YKA6、A0A7C9E2E3。大多数蛋白都含有多个磷酸化位点,其中含磷酸化位点最多的是A0A7C8ZMJ5(Ser 46个,Thr 17个,Tyr 9个),最少的A0A7C8YL60(Ser 2个,Thr 4个,Tyr 2个)。(3)以火龙果种子提取出的白蛋白为原料之一,经过试验,设计出一款火龙果种子白蛋白保湿霜,并确定出其最佳配比,制备流程等,并参考了《化妆品行业规范》(2015版)对其质量和保湿性能进行了评定。膏体洁白细腻有光泽,粘稠度正好,保湿效果良好。综上所述,本文采用定量蛋白质组学技术,对越南红心和白心火龙果种子白蛋白的蛋白质组进行了分析,并对火龙果种子白蛋白在护肤品中的应用进行了初探,为火龙果种子白蛋白的进一步应用提供了参考。
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