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减轻同种异体皮肤排斥反应、延长烧伤创面移植物的存活时间是大面积烧伤治疗亟待解决的关键问题之一。郎格罕斯细胞（LC）是引起异基因皮肤移植排斥反应的启动细胞。CCL20主要由活化的角质形成细胞产生,是诱导CD34+造血干细胞来源的LC前体向表皮迁移的强有力的趋化因子。抑制CCL20基因在角质形成细胞的表达可以减少受者的LC向异基因组织工程皮肤内迁移,削弱间接抗原提呈途径,从而减轻受者对皮肤移植物的排斥反应。人永生化角质形成细胞系（HaCaT）不仅具有与表皮干细胞相似的表型、增殖和分化特性,而且其遗传特性稳定、不具有成瘤性,可作为组织工程皮肤种子细胞的理想候选者。若能对HaCaT的CCL20基因进行长期稳定的修饰（敲除或干扰）,则可能达到改良组织工程皮肤种子细胞的目的。因此,本研究拟构建CCL20基因敲除的置换型打靶载体,将打靶载体DNA与人角质形成细胞DNA进行同源重组,克隆筛选后进行鉴定及打靶载体转染方法的探索,并检测干细胞相关的转录因子在HaCaT及基因敲低型细胞克隆内mRNA的表达及蛋白水平的变化,为CCL20基因修饰的低排斥反应的组织工程皮肤表皮种子细胞的筛选提供新的理论基础。目的1.构建CCL20基因敲除的置换型打靶载体ploxP-hCCL20,将打靶载体DNA与人角质形成细胞DNA进行同源重组,进行相关的鉴定,拟筛选出CCL20基因敲除型细胞。2.基于前一部分的研究结果,构建ploxP-hCCL20-EGFP荧光表达质粒,进行了分子量较大的打靶载体不同转染方法的探索,观察了HaCaT细胞内荧光表达情况。3.在mRNA和蛋白水平上观察CCL20基因敲低型细胞克隆内干细胞相关转录因子的变化,为低排斥反应的组织工程皮肤种子细胞的筛选提供新的理论基础。方法1.设计和合成引物,利用长距离PCR从HaCaT细胞基因组DNA中克隆出CCL20基因组DNA片段,再以CCL20基因为模板扩增带酶切位点的同源短臂及同源长臂,分别插入ploxP载体的Neo基因上游和下游,利用T载体及基因克隆技术,构建重组质粒ploxP-hCCL20置换型打靶载体。2.将打靶载体经EcoR I单酶切线性化后,并以电穿孔方法转染HaCaT,经G418及GANC正负压力筛选及细胞培养,观察克隆的形成。3.在打靶载体的同源短臂的上游及同源长臂的下游设计一对引物,跨过Neo基因,以克隆筛选后的HaCaT基因组DNA为模板进行扩增作PCR鉴定。4.在人CCL20基因第3外显子区域设计同源探针,经Primer Premier分析选SacI/KpnI或AccI/KpnI将细胞基因酶切,作Southern blotting印迹杂交鉴定。5. pEGFP-N2质粒中的启动子CMV IE及EGFP片段克隆至ploxP-hCCL20重组质粒中的Asp718及EcoRI酶切位点之间,构建ploxP-hCCL20-EGFP荧光表达质粒。6.将ploxP-hCCL20-EGFP荧光表达质粒以jetPEI脂质体及电穿孔联合核转染试剂转染293FT或HaCaT细胞,观察细胞内荧光表达情况并计算细胞转染率。7.采用流式细胞术观察HaCaT及11株CCL20基因敲低型细胞克隆（1-2、1-7、1-4、1-3、1-5、2-4、2-6、2-11、2-9、2-10及2-3）内干细胞相关转录因子Oct-4、Sox-2、Nanog、FGF-4、Rex-1及TERT百分率的变化。8.以GAPDH为内标,采用荧光定量PCR技术,初步观察HaCaT及11株克隆细胞Oct-4、Sox-2及Nanog mRNA相对表达量的变化。9.以GAPDH为内标,采用荧光定量PCR技术,初步观察HaCaT、成人包皮角质形成细胞及人羊膜组织Oct-4、Sox-2、Nanog及Rex-1 mRNA相对表达量的变化。10.根据初筛结果,以GAPDH为内标,采用荧光定量PCR技术,对HaCaT、1-4、1-2、2-9及2-10克隆进行Oct-4、Sox-2、Nanog及Rex-1 mRNA相对表达量的检测。11.以GAPDH为内参,采用Western blotting方法,对HaCaT、1-4、1-2、2-9及2-10克隆进行Oct-4、Sox-2、Nanog、Rex-1及TERT蛋白水平的检测。结果1.长距离PCR从HaCaT细胞基因组DNA中克隆出CCL20基因组DNA片段（4459bp）,获得带酶切位点NotI/XhoI的同源短臂（1969bp）及带酶切位点Xbal/ClaI的同源长臂（2356bp）。构建了针对人CCL20基因外显子2的置换型打靶载体ploxP-hCCL20（11.9kb）,经PCR、双酶切鉴定正确。将测序结果与Genebank中人的CCL20基因全长序列（NT005403）相比对,结果提示:同源短臂有两个位点发生变异,115位G→A,1274位A→G。同源长臂有三个位点发生变异,2228位T→C,3310位T→A,4208位A→G。发生变异的碱基均不在外显子序列上,考虑为单核苷酸多态性导致。同源短臂中包含了外显子1及部分内含子,同源长臂包含了外显子3、4及部分内含子。2.经G418及GANC正负压力筛选,先后共获得18个克隆,用PCR初筛鉴定,显示为409bp单条带,表明为野生型。5个克隆共作了5次Southern印迹杂交,未出现2943bp及4684bp杂合子型所表现的条带。PCR初筛及Southern印迹杂交均未发现基因敲除的克隆。3.电泳及测序结果显示成功构建了ploxP-hCCL20-EGFP荧光表达质粒（13.3 kb）。线性化质粒用jetPEI脂质体转染293FT细胞,有较强的绿色荧光表达,转染率为75.1%,HaCaT的转染率1.3%。用电穿孔联合核转染试剂转染HaCaT,阳性对照pmaxGFP的转染率为38.3%,而ploxP-hCCL20-EGFP质粒转染HaCaT后荧光表达极少且很弱,转染率为0.3 %。4.Oct-4及Sox-2双标的流式细胞术分析显示:与HaCaT（94.58±1.08%）相比,11株克隆中2-4克隆Oct-4+Sox-2+表达的百分率下降,为88.31±1.17% （P=0.040）,1-3（69.84±1.17%）和2-11克隆（67.10±1.03%）明显下降（P<0.01）,2-6及2-9克隆表达最低,分别为25.51±2.25%和22.95±3.31% （P=0.000; P=0.002）,其余克隆无显著性差异。5.Nanog、FGF-4、Rex-1及TERT单标的流式细胞术分析显示: Nanog在HaCaT表达的百分率为59.94±8.49%,2-6克隆（8.23±4.91%）较对照组HaCaT相比有所下降（P=0.027）,其余克隆无明显变化,一般在13.51%至60.79%之间（P>0.05）。FGF-4在HaCaT表达的百分率相当高,为99.27±0.38%,克隆细胞表达的百分率整体较高,一般在76.51%至95.31%之间,2-9 （79.81±0.41%）和2-10克隆（92.75±0.46%）与对照组相比有十分显著地下调（P=0.000, P=0.001）。Rex-1在HaCaT表达的百分率最高,为99.32±0.32%,2-9 （78.76±1.23%）与HaCaT相比有显著性下调（P=0.005）,其余克隆阳性率高,一般在87.02%至98.10%之间波动,与对照组相比无明显变化。TERT在HaCaT表达的百分率极低,为1.00±0.82%,荧光极弱。2-4的表达率最高,也仅为50.31±0.93%,大多数克隆无明显差异。这些提示HaCaT细胞及克隆细胞有一定的干细胞特性。6.11株克隆Oct-4、Sox-2及Nanog荧光定量PCR初筛结果显示（RQ=2-??Ct）: Oct-4 mRNA:0<RQ≤1之间的克隆:1-4;1<RQ≤3之间的克隆:1-2,1-7,2-4;3<RQ≤6之间的克隆:1-5,2-3,2-11;6<RQ≤9之间的克隆:1-3,2-9,2-10;RQ>9的克隆:2-6。Sox-2 mRNA:0<RQ≤1之间的克隆:1-3、1-4;1<RQ≤3之间的克隆:1-2,2-9,2-4;3<RQ≤6之间的克隆:1-5,1-7,2-6,2-10和2-3;6<RQ≤9之间的克隆:2-11。Nanog mRNA:1<RQ≤3之间的克隆:1-4;3<RQ≤6之间的克隆:2-11;6<RQ≤9之间的克隆:1-2,2-4;RQ>9的克隆:1-7,1-3,1-5,2-9,2-6,2-10和2-3。7.初步结果显示,与HaCaT（RQ=1）相比,Oct-4、Sox-2、Nanog及Rex-1 mRNA在成人包皮角质形成细胞及人羊膜组织中高表达,RQ值最低为24.549,最高4.886×103。8.2-9及2-10克隆的荧光定量PCR显示:与HaCaT相比,2-9克隆Nanog表达明显增高,为6.50±1.76（P=0.007）,其余转录因子Oct-4、Sox-2及Rex-1mRNA的表达无明显变化。2-10克隆的Oct-4、Sox-2、Nanog及Rex-1 mRNA的表达与HaCaT相比无明显差异。9.2-9及2-10克隆的Western blotting结果显示:与HaCaT相比,这两个克隆的Rex-1蛋白表达无显著性差异,但Oct-4、Sox-2、Nanog及TERT的蛋白表达均明显升高（P<0.05）。10.1-4及1-2克隆的荧光定量PCR显示:与HaCaT相比,1-4克隆Sox-2及Rex-1mRNA的表达明显降低（P=0.017; P=0.043）,而Oct-4与Nanog无明显变化。与之相反,1-2克隆Oct-4与Nanog mRNA的表达较HaCaT明显增高（P=0.047; P=0.029）, Sox-2及Rex-1却无明显差异。11.1-4及1-2克隆的Western blotting结果显示:HaCaT、1-4及1-2克隆的Oct-4、Sox-2及TERT的蛋白表达均极低,各组之间无明显差异。与HaCaT相比,1-4克隆Nanog及Rex-1的蛋白表达明显降低（P=0.000; P=0.018）,1-2克隆Nanog蛋白的表达明显降低（P=0.000）,Rex-1无明显变化。结论1.成功构建了针对人CCL20基因外显子2的置换型打靶载体ploxP-hCCL20,以此转染HaCaT所获的18个克隆经PCR和Southern印迹杂交鉴定无CCL20基因敲除杂合子细胞克隆。2.成功构建ploxP-hCCL20-EGFP荧光表达质粒,经转染HaCaT分析转染效率低下的原因,可能与打靶载体分子量较大和HaCaT难以转染有关,改进转染方法有可能获得基因敲除克隆。3.11株CCL20基因敲低型细胞克隆的干细胞转录因子表达的百分率及mRNA发生了不同的变化,表明基因修饰干扰了Oct-4、Sox-2、Nanog、FGF-4、Rex-1、TERT mRNA及蛋白水平的表达。4.HaCaT的干细胞转录因子Oct-4、Sox-2、Nanog及Rex-1 mRNA表达量明显比成人包皮角质形成细胞及羊膜组织低。5.2-9及2-10克隆与HaCaT相比干细胞转录因子Oct-4、Sox-2、Nanog及TERT蛋白表达明显增高,提示这两个CCL20基因敲低型克隆的干细胞转录因子确实发生了变化,值得进一步探索其发生的机制。6.1-2及1-4克隆表达Oct-4+Sox-2+、Nanog、Rex-1及TERT的百分率与HaCaT相比无显著改变,同时相应的蛋白表达呈低或极低水平,有可能作为组织工程皮肤种子细胞的候选者进一步研究其细胞生物学特性。