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肝脏移植(Liver transplantation，LTx)是治疗终末期肝病唯一有效的方法，然而由于供体器官的短缺的限制，活体肝移植(Live donor liver transplantation，LDLT)临床应用的重要性日益突出。影响成人-成人LDLT疗效最关键的因素之一仍然是活体供肝的大小，临床研究发现占受体估计标准肝容量(Estimated stand ard liver volume，ESLV)40％的移植物是供肝选择的底线，移植物大小低于40％ESLV者术后极易出现小体积综合征(Small-for-size syndrome)表现，原发性肝脏无功能的发生率明显增加。这使得小体积肝移植的供体选择受到严格限制。动物实验发现，小体积移植肝再灌注早期，由于容积限制，门静脉入肝血流相对过度和暂时性的门静脉高压状态造成的高灌注状态破坏了肝脏微循环状态，导致移植物早期细胞功能与结构受损。如何基于小体积移植肝过度血流灌注损伤的特殊性，在基因水平开展移植物的保护性研究，从而安全地扩展供肝来源，利用有限体积的供肝使病人获得理想的肝功能支持是一个富有潜力的研究方向。一些与肝脏的微循环调节有关的、参与肝脏缺血再灌注(Ischemia-reperfusion，I/R)损伤机制的重要血管活 浙江大学博士学位论文 性介质如一氧化氮 （Nitri oxide，NO）、内皮素（Endothelin，ET）、血红素氧合酶 （HemcoxygCnase－l，HO，l）以及一些前炎性基因（Proinflammatory genes）如诱导型 一氧化氮合成酶（Inducible ndric oxide Synhase，iNOS）等的研究正方兴未艾。至于 小体积尤其是边缘性肝脏移植物内ET－！、iNOS的表达及其相互联系尚缺乏深入 的研究。最近在调节炎性反应、免疫应答以及抗细胞凋亡等方面，保护性基因 A20倍受关注。据推测细胞内 A20的诱导依赖于核转录因子 NF－KB州＂clear factor－oh）的激活，同时A20又对NF。B的激活起负反馈调节作用，能抑制某些 NF．KB依赖性的前炎性基因的表达，从而发挥保护作用。A20基因在肝脏移植以 及缺血再灌注领域的研究尚属空白。因此，本课题利用特殊大小的边缘性体积肝 脏移植模型，对移植物内A20、ET－l及其相关基因的表达状态开展了初步研究。 材料与方法 1．建立边缘性体积大同肝脏移植模型 实验动物选用成年雄性 Lewis大鼠，采用 Pentobarbitone sodium腹腔内注射麻 醉。经大鼠肝脏各部分百分率测定，选择适宜肝叶作为供肝。大鼠肝脏移植模型 血管重建技术采用无肝动脉血供的双套管法，供肝采用离体减体积方式。为观察 生存率，设立两组实验：边缘性体积肝移植组（MaFginal size nft gfoup for survival investigation，Ms组）采用经体外减积到接近40％受体自身肝脏重量的移植肝，全肝 移植组（Whole uft group for survival investigation，Ws组）采用与受体自身肝脏重量 相若的全体积的移植肝。 2．边缘性体积移植肝内基因表达的相关研究 设立全肝移植组（Whole nft group，W组）和边缘性体积肝移植组（Mafgina size nft grouP，M组）。所有移植大鼠受体于再灌注 24 ，J’时内各个规定时点处死，采 集血和组织标本。实验方法学包括生化学检测肝功能：苏木素伊红比ma山WIh－ eosin）染色组织形态学观察；逆转录聚合酶链式反应（Reverse transcriptiolt－－ polpoerase chain reachon，RTPCR）检测 A20、ABIN－2、iNOS的 1llliriA水平； 免疫组织化学染色法检测A20、ET－l、iNOS的蛋白表达。 一4一 一 3．统计学方法 所有实验数据经 SPSS 10．0软件进行统计学处理，P＜ 0．05判定有统计学差异。 结 果 经测定大鼠肝脏各部分百分率，选择占全肝重量38．5士03％的肝中叶为移植 物，建立接近40％的边缘性体积肝脏移植模型。MS组和Ws组大鼠的7天存活率 分别为！6．7％和9！．7％，两组存活率有显著性差异，P＜o．帆1。受体大鼠再灌注早 期6小时ALT、AST和TB等肝功能指标达到峰值，再灌注后24小时M组大鼠 ＊＊T、＊盯和＊B水平高于w组，有统计学差异，P＜O．05。＊T．叮R结果显示M 组大鼠移植肝内A20转录水平在30min即己上调，6 ，J’时