论文部分内容阅读
目的：
1建立生物检材中双酯型乌头生物碱(DDAs)及其代谢物的样品前处理和高效液相色谱串联质谱(HPLC-MS/MS)检测方法。
2探究DDAs及其代谢物的死后分布及分解动力学规律，为乌头生物碱相关案件的检材选取及保存提供实验基础，同时为乌头生物碱中毒和死亡案件判别生前服毒和死后灌毒奠定理论依据。
方法：
1.受试动物：健康家兔(山西医科大学动物中心，SCXK(晋)2015-0003)，雄性。本研究方案通过伦理学审查(编号：2018LL350)。
2.模型建立
2.1死后分布动物模型：
健康家兔9只，雄性，适应环境1周后禁食12h，灌胃。随机选取3只作为空白对照组；6只作为给药组，给药组以生川乌煎剂中AC(乌头碱)的LD50剂量灌胃，待呼吸心跳停止后立即取材，供仪器分析。
2.2分解动力学动物模型
(1)空白添加组
空白兔血及肝(剪碎，研磨)平均分为三组，每组三等份，每组分别添加AC纯品、MA(新乌头碱)纯品、HA(次乌头碱)纯品(将所有添加后的检材超声混匀)；每组的第一份、第二份、第三份分别置于20℃、4℃以及-20℃的保存条件下；取非常规毒物中毒尸体血，添加乌头碱纯品,三等份，分别放置于不同保存条件下。规定时间内，分别取样检测。
(2)染毒动物检材组
取健康家兔18只，雄性，适应环境1周后禁食12h，灌胃。随机选取6只为空白对照组；剩余家兔随机均分为2组，分别以生川乌煎剂中对应AC的LD50、10LD50剂量灌胃，常规取材，所取检材平均分为三组，分别置于20℃、4℃以及-20℃的保存条件下，检测时间同上。
3.提取检测方法
生物检材添加内标盐酸普罗地芬(SKF)后，液液萃取法提取，采用LC/MS/MS检测方法，以定性离子对保留时间和相对丰度比定性，内标法定量。
4.数据处理方法：DAS3.0药代动力学软件；SPSS19.0统计学软件。
结果：
1.双酯型乌头生物碱及其代谢物的LC-MS/MS分析检测：
经测定家兔血液中，DDAs及其代谢物的线性范围为0.08~133.33ng/mL，最低检出限(LOD)在0.05~0.22ng/mL范围内，最低定量限(LOQ)在0.17~0.73ng/mL范围内；家兔肝脏中，DDAs及其代谢物的线性范围为0.08~75.00ng/g，LOD在0.01~0.32ng/mL范围内，LOQ在0.03~1.07ng/mL范围内；在家兔血液和肝脏中DDAs及其代谢物的相关系数(r)均大于0.99，日内和日间精密度均小于20%，提取回收率均大于50%，基质效应均在80%~120%范围内。
2.染毒生物检材中DDAs及其代谢物的死后分布研究：
双酯型乌头生物碱及其代谢物在染毒动物体内含量变化依次为：
(1)AC：外周血＞心血＞胃＞肺＞肾＞心＞肝＞肌＞脾
(2)MA：外周血＞心血＞肺＞胃＞肾＞肝＞肌＞脾＞心
(3)HA：外周血＞心血＞胃＞肺＞脾＞肾＞肌＞肝＞心
(4)BAC：外周血＞心血＞胃＞脾＞肾＞肺＞肌＞心＞肝
(5)BMA：外周血＞心血＞胃＞脾＞肾＞肌＞肝＞肺＞心
(6)BHA：外周血＞心血＞胃＞肾＞脾＞肺＞肌＞肝＞心
(7)Aconine：外周血＞心血＞肾＞胃＞心＞肝＞脾＞肌＞肺
(8)Mesaconine：外周血＞心血＞肌＞脾＞肾＞肝＞胃＞心＞肺
(9)Hypaconine：外周血＞心血＞肾＞胃＞肝＞心＞肺＞脾＞肌
在乌头类生物碱中毒死亡案件中，可依次选择血液检材、含有胃内容的胃组织和肝、肺等含血量丰富的脏器作为送检检材。
3.分解动力学：
通过本论文得出：体内双酯型乌头生物碱分解快速，主要分解为单酯型乌头生物碱和醇胺型乌头生物碱。
在不同保存条件(4℃、20℃和-20℃)下，双酯型乌头生物碱及其代谢物的分解动力学变化规律为：
(1)温度越高，双酯型乌头生物碱及其代谢物的检出时限越短，建议在送检过程中低温冷冻保存。
(2)同样保存温度下，灌胃药物浓度越高，检出时限越长；醇胺型乌头生物碱检出时间越早。
(3)同样保存条件下，外周血检出时限最长，(因心血检材量有限，不能继续监测药物分解过程，需进一步实验完善)。
(4)相同保存条件下，心脏中双酯型乌头生物碱及其代谢物的分解速率最快，不建议送检。
(5)本论文研究表明，-20℃保存条件下，10LD50灌胃组的脏器在保存的3~7天和60~172天内检测出醇胺型乌头生物碱，而LD50灌胃组的脏器中未检出，提示在尸体新鲜检材(7天内)和较陈旧检材(大于60天)检出醇胺型乌头生物碱，可能为乌头碱中毒死亡。
此外，本论文研究结果得到了DDAs及其代谢物在不同保存条件下不同检材中的分解动力学参数，根据DAS3.0给出的理论值与实测值符合关系良好，可同时运用本实验结果中成功拟合到的分解动力学参数来推测保存检材中DDAs浓度的经-时过程，推测取材当时检材中的毒物浓度。
结论：
1.建立了DDAs及其代谢物的LC-MS/MS检测方法，样品前处理过程简单快速；检测方法灵敏度高、回收率高，可用于乌头生物碱中毒和死亡案例中毒物的分析测定。
2.染毒家兔不同脏器检材中均检测出DDAs及其代谢物，在外周血、心血中含量较高，此外主要分布在胃、肺、肝、肾、脾等脏器。
3.DDAs及其代谢物在不同保存温度下均可发生分解，20℃保存条件下分解较快，-20℃保存条件下分解最慢。在乌头生物碱相关中毒和死亡实际案件中，应该保证检材在低温冷冻保存的条件下及时送检，在检测过程中，应同时检测。
4.本论文成功拟合出DDAs及其代谢物的分解动力学方程，计算的理论值与实测值符合关系良好，可推算出取材时心血、外周血、肝脏、肾脏、肺脏等脏器内DDAs及其代谢物的浓度，为乌头生物碱相关中毒和死亡案件的毒物分析结果提供理论依据。
1建立生物检材中双酯型乌头生物碱(DDAs)及其代谢物的样品前处理和高效液相色谱串联质谱(HPLC-MS/MS)检测方法。
2探究DDAs及其代谢物的死后分布及分解动力学规律，为乌头生物碱相关案件的检材选取及保存提供实验基础，同时为乌头生物碱中毒和死亡案件判别生前服毒和死后灌毒奠定理论依据。
方法：
1.受试动物：健康家兔(山西医科大学动物中心，SCXK(晋)2015-0003)，雄性。本研究方案通过伦理学审查(编号：2018LL350)。
2.模型建立
2.1死后分布动物模型：
健康家兔9只，雄性，适应环境1周后禁食12h，灌胃。随机选取3只作为空白对照组；6只作为给药组，给药组以生川乌煎剂中AC(乌头碱)的LD50剂量灌胃，待呼吸心跳停止后立即取材，供仪器分析。
2.2分解动力学动物模型
(1)空白添加组
空白兔血及肝(剪碎，研磨)平均分为三组，每组三等份，每组分别添加AC纯品、MA(新乌头碱)纯品、HA(次乌头碱)纯品(将所有添加后的检材超声混匀)；每组的第一份、第二份、第三份分别置于20℃、4℃以及-20℃的保存条件下；取非常规毒物中毒尸体血，添加乌头碱纯品,三等份，分别放置于不同保存条件下。规定时间内，分别取样检测。
(2)染毒动物检材组
取健康家兔18只，雄性，适应环境1周后禁食12h，灌胃。随机选取6只为空白对照组；剩余家兔随机均分为2组，分别以生川乌煎剂中对应AC的LD50、10LD50剂量灌胃，常规取材，所取检材平均分为三组，分别置于20℃、4℃以及-20℃的保存条件下，检测时间同上。
3.提取检测方法
生物检材添加内标盐酸普罗地芬(SKF)后，液液萃取法提取，采用LC/MS/MS检测方法，以定性离子对保留时间和相对丰度比定性，内标法定量。
4.数据处理方法：DAS3.0药代动力学软件；SPSS19.0统计学软件。
结果：
1.双酯型乌头生物碱及其代谢物的LC-MS/MS分析检测：
经测定家兔血液中，DDAs及其代谢物的线性范围为0.08~133.33ng/mL，最低检出限(LOD)在0.05~0.22ng/mL范围内，最低定量限(LOQ)在0.17~0.73ng/mL范围内；家兔肝脏中，DDAs及其代谢物的线性范围为0.08~75.00ng/g，LOD在0.01~0.32ng/mL范围内，LOQ在0.03~1.07ng/mL范围内；在家兔血液和肝脏中DDAs及其代谢物的相关系数(r)均大于0.99，日内和日间精密度均小于20%，提取回收率均大于50%，基质效应均在80%~120%范围内。
2.染毒生物检材中DDAs及其代谢物的死后分布研究：
双酯型乌头生物碱及其代谢物在染毒动物体内含量变化依次为：
(1)AC：外周血＞心血＞胃＞肺＞肾＞心＞肝＞肌＞脾
(2)MA：外周血＞心血＞肺＞胃＞肾＞肝＞肌＞脾＞心
(3)HA：外周血＞心血＞胃＞肺＞脾＞肾＞肌＞肝＞心
(4)BAC：外周血＞心血＞胃＞脾＞肾＞肺＞肌＞心＞肝
(5)BMA：外周血＞心血＞胃＞脾＞肾＞肌＞肝＞肺＞心
(6)BHA：外周血＞心血＞胃＞肾＞脾＞肺＞肌＞肝＞心
(7)Aconine：外周血＞心血＞肾＞胃＞心＞肝＞脾＞肌＞肺
(8)Mesaconine：外周血＞心血＞肌＞脾＞肾＞肝＞胃＞心＞肺
(9)Hypaconine：外周血＞心血＞肾＞胃＞肝＞心＞肺＞脾＞肌
在乌头类生物碱中毒死亡案件中，可依次选择血液检材、含有胃内容的胃组织和肝、肺等含血量丰富的脏器作为送检检材。
3.分解动力学：
通过本论文得出：体内双酯型乌头生物碱分解快速，主要分解为单酯型乌头生物碱和醇胺型乌头生物碱。
在不同保存条件(4℃、20℃和-20℃)下，双酯型乌头生物碱及其代谢物的分解动力学变化规律为：
(1)温度越高，双酯型乌头生物碱及其代谢物的检出时限越短，建议在送检过程中低温冷冻保存。
(2)同样保存温度下，灌胃药物浓度越高，检出时限越长；醇胺型乌头生物碱检出时间越早。
(3)同样保存条件下，外周血检出时限最长，(因心血检材量有限，不能继续监测药物分解过程，需进一步实验完善)。
(4)相同保存条件下，心脏中双酯型乌头生物碱及其代谢物的分解速率最快，不建议送检。
(5)本论文研究表明，-20℃保存条件下，10LD50灌胃组的脏器在保存的3~7天和60~172天内检测出醇胺型乌头生物碱，而LD50灌胃组的脏器中未检出，提示在尸体新鲜检材(7天内)和较陈旧检材(大于60天)检出醇胺型乌头生物碱，可能为乌头碱中毒死亡。
此外，本论文研究结果得到了DDAs及其代谢物在不同保存条件下不同检材中的分解动力学参数，根据DAS3.0给出的理论值与实测值符合关系良好，可同时运用本实验结果中成功拟合到的分解动力学参数来推测保存检材中DDAs浓度的经-时过程，推测取材当时检材中的毒物浓度。
结论：
1.建立了DDAs及其代谢物的LC-MS/MS检测方法，样品前处理过程简单快速；检测方法灵敏度高、回收率高，可用于乌头生物碱中毒和死亡案例中毒物的分析测定。
2.染毒家兔不同脏器检材中均检测出DDAs及其代谢物，在外周血、心血中含量较高，此外主要分布在胃、肺、肝、肾、脾等脏器。
3.DDAs及其代谢物在不同保存温度下均可发生分解，20℃保存条件下分解较快，-20℃保存条件下分解最慢。在乌头生物碱相关中毒和死亡实际案件中，应该保证检材在低温冷冻保存的条件下及时送检，在检测过程中，应同时检测。
4.本论文成功拟合出DDAs及其代谢物的分解动力学方程，计算的理论值与实测值符合关系良好，可推算出取材时心血、外周血、肝脏、肾脏、肺脏等脏器内DDAs及其代谢物的浓度，为乌头生物碱相关中毒和死亡案件的毒物分析结果提供理论依据。