【摘 要】
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白菜中发现的小分子碱性蛋白BP-10被证明是一种植物非特异性转脂蛋白(nsLTPs)，也是一种不依赖于Ca2+的钙调素结合蛋白。本实验室的研究证明BP-10参与了植物抗性反应，为进一步确
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白菜中发现的小分子碱性蛋白BP-10被证明是一种植物非特异性转脂蛋白(nsLTPs)，也是一种不依赖于Ca2+的钙调素结合蛋白。本实验室的研究证明BP-10参与了植物抗性反应，为进一步确定其可能的作用机制，我们首先通过蛋白组学的方法对与BP-10相互作用的蛋白进行分离鉴定。凝胶覆盖技术(Gel-overlay)被广泛应用于蛋白相互作用的研究中，本论文成功建立了碱性小分子蛋白BP-10的胶体金标记，并通过斑点杂交实验证明方法的可靠性和特异性。通过凝胶覆盖分析(Gel-overlay)从白菜蛋白粗提液中发现一个可与BP-10特异性结合的35kD的蛋白条带，利用Pull-down、免疫共沉淀从白菜粗蛋白提取液中分离了这一蛋白，并对该蛋白条带进行质谱分析鉴定，确定其是甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)。提取白菜总RNA进行反转录，参考GenBank中已登录的几种双子叶植物GAPDH保守区域，设计简并引物进行RT-PCR，克隆了GAPDH基因。将获得的GAPDH基因连接到pET32M表达质粒，转化Ecoil.BL21(DE3) TrxB-大肠杆菌，得到可诱导表达GAPDH融合蛋白的菌株。在16℃下用IPTG诱导表达获得GAPDH融合蛋白，以融合蛋白为研究对象，通过凝胶覆盖分析、凝胶过滤层析以及Pull-down等方法进一步证明了GAPDH与BP-10存在蛋白相互作用。近年来研究发现GAPDH是一种多功能蛋白，不仅在真核生物糖代谢中起重要作用，在一些胁迫条件下，植物GAPDH也表现出一定的胁迫响应。BP-10与GAPDH功能上的相似性也从侧面反映了两者可能同时存在于植物抗性防御反应信号网络中，本研究为进一步确定植物抗性反应机制提供了线索。
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