论文部分内容阅读
鸡传染性支气管炎（IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（IBV）引起鸡的一种急性接触性传染病，目前对IBV分子生物学的研究主要集中在S基因上，而对IBV其他基因的研究则相对较少。因此，本实验在完成对IBV国内分离株LX4 S基因的克隆、测序与比较分析后，进一步对IBV基因组5′末段2.2kb的片段（5a、5b、N及3′UTR）进行了克隆、测序与遗传变异分析。并进一步对N基因进行原核表达与纯化，以确定其应用于IB诊断的可行性。 本实验参照已发表的IBV基因序列设计合成了一对引物，对IBV新疆分离株LX4经RT-PCR扩增得到我国地方分离株LX4 mRNA5和mRNA6的全部cDNA大小约1.7kb的片段。将该片段克隆并进行序列测定，与国内外部分参考毒株的相应序列比较分析发现：LX4 5a基因与Beau、CU-T2、DE072、D1466、D971及SD/97/02毒株核苷酸及推导氨基酸序列同源性分别在83％和86％以下，而其他株间5a基因均在90％以上。5b基因与上述毒株核苷酸及推导氨基酸序列同源性分别在87％和86％以上，其中5b基因核苷酸及推导的氨基酸序列均与D971同源性最高。LX4N基因与Ark99、Beau、Gray、M41、H120、H52、SD/97/02、D971、ZJ971、DB、HB及N毒株的N基因核苷酸及推导氨基酸同源性比较结果发现其中LX4 N基因与HB和SD/97/02同源性较高，与其他毒株同源性相对较低。对已报道的N基因所编码蛋白的三个保守碱性区及推测的多个功能区推导氨基酸同源性比较进一步提示：我国地方分离株LX4 mRNA5和mRNA6的cDNA序列与国内其他分离株同源性相对较高，这表明他们之间具有较近的遗传演化关系。但在LX4 N基因的局部功能区内，其核苷酸和推导氨基酸与H52和/或H120存在很高的同源性，这表明LX4的存在可能与我国应用IBV疫苗株H52和H120有一定的联系。 本研究将鸡传染性支气管炎病毒国内分离株IBV-LX4 N基因亚克隆于大肠杆菌原核表达质粒pPROEXTMHTa中，构建拟表达重组鸡传染性支气管炎病毒N蛋白的重组质粒pPROEXTMHTa-N。经核苷酸序列测定后的阳性质粒转化E.coli DH5α进行诱导表达。表达产物经SDS-PAGE、Western blot鉴定表明N蛋白在大肠杆菌中获得了表达，产物分子量分别为约56KDa和45KDa的蛋白，其中分子量为56KDa的蛋白表达量约为菌体总蛋白量的13％。包涵体被6M盐酸胍裂解后，经ProBondTM蛋白质纯化试剂盒纯化。将纯化后分子量为56KDa的重组蛋白进行兔体免疫，制备兔抗鸡N蛋白多克隆抗体并分别与不同致病型鸡传染性支气管炎病毒进行琼脂扩散反应，结果表明该多克隆抗体可与各不同致病型毒株发生反应，但与亲本毒株的反应性更好。这表明鸡的传染性支气管炎病毒N蛋白有望作为群特异性诊断抗原用于IB的诊断中。