膜联蛋白是一个Ca²⁺依赖的磷脂结合蛋白家族,从上世纪70年代末发现第一个膜联蛋白至今,在脊椎类生物中已发现了12个家族成员。它们在结构上都具有高度保守的C末端,由70-80个氨基酸构成4个重复序列;同时,在N端由于氨基酸的排列顺序不同而功能各异。其中膜联蛋白A5是人体内分布较广,表达较多的一种膜联蛋白,其确切的生理功能还不清楚;目前对其研究较多的是其抗凝血功及其对细胞凋亡的体内外检测功能,但其是否与肿瘤的发生发展相关,目前国内外报道均极为少见。宫颈癌是女性最常见的肿瘤之一,其发病率和病死率仅次于乳腺癌而位居第二。在全世界,每年都有约37万妇女被诊断为宫颈癌,而存活率还不到40%。尽管当今医学对宫颈癌采取了手术、化疗等手段,但如此之低的生存率迫使医务工作者尽早发现宫颈癌并对其发生发展的机制进行探索从而做到有针对性的治疗。目前,基因组学、蛋白质组学以及分子生物学技术的飞速发展给肿瘤的研究提供了一条新途径,有助于在肿瘤复杂的发生发展过程中发现不同的基因表达并通过它们之间的联系而探索肿瘤的发生机理从而指导临床治疗。本研究以人宫颈鳞癌为肿瘤模型,研究了在宫颈鳞癌的发生发展过程中膜联蛋白A5的表达改变,从而为宫颈癌的发现提供了早期诊断指标;在确定了膜联蛋白A5与宫颈癌具有相关性后,为进一步探讨膜联蛋白A5对细胞增殖和凋亡可能发生的影响,我们一方面构建了膜联蛋白A5的重组质粒,通过将此重组质粒转染宫颈癌细胞使其过表达膜联蛋白A5来检测细胞功能的改变,另一方面我们采用RNA干扰技术,抑制膜联蛋白A5在细胞中的表达来观察细胞功能的改变,从而确定了膜联蛋白A5对肿瘤细胞发挥的作用。最后,我们又对膜联蛋白A5发挥作用的机理进行了探讨。通过此层层深入的研究,不但搞清了膜联蛋白A5与宫颈癌的相关性,还探讨了其在肿瘤发生发展过程中的作用,为临床早期诊断和治疗宫颈癌提供了理论基础。第一部分膜联蛋白A5在宫颈鳞癌及宫颈癌细胞系中的表达研究目的:观察膜联蛋白A5在宫颈鳞癌中的表达改变以及在宫颈癌细胞系细胞中的表达以确定其与宫颈癌的相关性。方法1采集标本:于承德医学院附属医院妇科收集新鲜宫颈鳞癌组织25例及正常宫颈组织15例;并于承德医学院附属医院病理科获得鳞癌蜡块26例,正常宫颈蜡块15例。2 western blotting、免疫组化法在蛋白水平检测肿瘤组和正常组ANXA5的表达差异。3原位杂交法在RNA水平检测肿瘤组和正常组ANXA5的表达差异。4 western blotting、免疫组化法体外检测宫颈癌细胞系Hela细胞和SiHa细胞中膜联蛋白A5的表达。结果1膜联蛋白A5在肿瘤组的表达于蛋白水平和转录水平均高于正常组,差异具有显著性（p<0.05）。2随着宫颈鳞癌的分化程度从高到低,膜联蛋白A5的表达逐渐增高。高分化组与中分化组的表达无显著性差异（p>0.05）,但均与低分化组之间有显著性差异（p<0.05）。3膜联蛋白A5在宫颈癌细胞系中有表达。结论1膜联蛋白A5与宫颈鳞癌的发生发展具有高度的相关性。2膜联蛋白A5表达水平与宫颈鳞癌的分化具有负相关性;宫颈鳞癌分化越低,膜联蛋白A5表达越高。3膜联蛋白A5可作为宫颈鳞癌早期诊断及其分化的marker。4膜联蛋白A5在体外宫颈癌细胞系中的表达与体内宫颈癌组织的表达具有一致性。第二部分膜联蛋白A5对细胞增殖及凋亡发生的影响目的1构建膜联蛋白A5的重组质粒并稳定转染宫颈癌细胞系细胞使其过表达膜联蛋白A5,通过观察细胞生物行为的改变而探讨膜联蛋白A5对肿瘤细胞发挥的作用。2应用RNA干扰技术抑制膜联蛋白A5在肿瘤细胞中的表达,通过观察细胞生物行为的改变而探讨膜联蛋白A5对肿瘤细胞发挥的作用。方法1构建pcDNA3.1-ANXA5和pEGFP-ANXA5两种重组质粒（1）构建pcDNA3.1-ANXA5质粒:大量扩增含pcDNA3.1质粒的大肠杆菌,抽质粒后用BamHI和XhoI进行酶切,获得带有BamHI和XhoI酶切位点的粘性末端的空质粒载体;设计膜联蛋白A5的引物,正向引物含BamHI酶切位点,反向引物含XhoI酶切位点,扩增含有膜联蛋白A5质粒的大肠杆菌,抽质粒后以此质粒为模板,PCR扩增出与pcDNA3.1空质粒带有相同酶切位点的膜联蛋白A5基因。用T4连接酶将pcDNA3.1空质粒与膜联蛋白A5基因相连,连接产物转化感受态大肠杆菌,涂板,挑克隆,摇菌抽质粒后酶切鉴定含膜联蛋白A5基因的克隆,大量扩增该克隆菌后抽质粒,得到pcDNA3.1-ANXA5重组质粒。（2）构建pEGFP-ANXA5质粒:大量扩增质粒上带有pEGFP基因的大肠杆菌,抽质粒后用XhoI和BamHI进行酶切,得到pEGFP空质粒载体;设计膜联蛋白A5的引物,正向引物含XhoI酶切位点,反向引物含BamHI酶切位点,扩增含有膜联蛋白A5质粒的大肠杆菌,抽质粒后以此质粒为模板,PCR扩增出与pEGFP空质粒带有相同酶切位点的膜联蛋白A5基因。用T4连接酶将pEGFP空质粒与膜联蛋白A5基因相连,连接产物转化感受态大肠杆菌,涂板,挑克隆,摇菌抽质粒后酶切鉴定含膜联蛋白A5基因的克隆,大量扩增该克隆菌后抽质粒,得到pEGFP-ANXA5重组质粒。（3）测序:将两种重组质粒送上海生工测序,测序结果与NCBI上genebank中人膜联蛋白A5序列进行比对。2转染细胞:用磷酸钙沉淀法将pcDNA3.1-ANXA5重组质粒和pEGFP-ANXA5重组质粒分别转染宫颈癌细胞系细胞SiHa细胞和Hela细胞,G418加压筛选,挑取细胞克隆,继续细胞培养。3阳性细胞的鉴定:对于转染了pcDNA3.1-ANXA5的SiHa细胞,通过western blotting的方法对所挑取的细胞克隆进行鉴定,膜联蛋白A5表达高于未转染细胞者为阳性细胞;对转染了pEGFP-ANXA5的Hela细胞在荧光显微镜下观察,有绿色荧光表达者为阳性细胞,并进一步用western blotting进行鉴定。4细胞功能的检测:将细胞分为空白对照组、转染空质粒组、转染膜联蛋白A5组;用MTT法检测阳性转染细胞的增殖速度;FITC-annexinV-PI免疫荧光法检测三组细胞的凋亡情况。5筛选抑制效应最大的siRNA:将从生物公司合成的三对siRNA转染Hela细胞,在转染细胞后48h用western blotting法检测膜联蛋白A5在蛋白水平的表达,表达最低者抑制效率最高,从而筛选出抑制效应最强的siRNA。6 RNA干扰:将筛选出的siRNA转染Hela细胞,48h后行细胞功能检测。7细胞功能的检测:将细胞接种于96孔板,转染siRNA,MTT法于转染后48h检测细胞增殖速率;采用细胞凋亡光学检测试剂盒对细胞凋亡情况进行检测。结果1 pcDNA3.1-ANXA5和pEGFP-ANXA5两种质粒经测序证实序列正确;2过表达膜联蛋白A5的肿瘤细胞其增殖率比未转染质粒的细胞以及转染了空质粒的细胞降低,差异具有显著性（p<0.05）;3过表达膜联蛋白A5的肿瘤细胞其凋亡率比未转染质粒的细胞以及转染了空质粒的细胞增高,差异具有显著性（p<0.05）;4经RNA干扰抑制了膜联蛋白A5表达的肿瘤细胞,其增殖速率与普通肿瘤细胞相比,差异不显著（p>0.05）;5经RNA干扰抑制了膜联蛋白A5表达的肿瘤细胞,其细胞凋亡率比普通肿瘤细胞的凋亡率减少,差异具有显著性（p<0.05）。结论内源性膜联蛋白A5具有促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖的作用。第三部分膜联蛋白A5发挥作用的机理研究目的:探讨膜联蛋白A5对宫颈癌细胞发挥作用的机理。方法1采用western blotting法和免疫组化法检测新鲜宫颈癌组织和正常宫颈组织中蛋白激酶C的表达改变。2采用免疫组化法检测RNA干扰后Hela细胞中bcl-2、bax、p53和蛋白激酶C的表达改变。结果1蛋白激酶C在肿瘤组织和正常宫颈组织中的表达差异不显著（p>0.05）。2 RNA干扰后低表达ANXA5的Hela细胞与普通Hela细胞相比:（1）蛋白激酶C的表达降低,具有显著性差异（p<0.05）;（2）bcl-2的表达增高,具有显著性差异（p<0.05）;（3）bax的表达降低,具有显著性差异（p<0.05）;（4）p53的表达降低,具有显著性差异（p<0.05）;结论1膜联蛋白A5发挥作用的机理可能是通过PKC发挥作用;2膜联蛋白A5的表达改变与促凋亡的凋亡相关基因如bax基因和p53基因表达具有一致性;与抑制凋亡的凋亡相关基因如bcl-2基因表达相反;3膜联蛋白A5基因是一种促凋亡基因。